人纤维连接蛋白(FN)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

纤维连接蛋白(FN)ELISA KIT用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中纤维连接蛋白(FN)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中纤维连接蛋白(FN)水平。用纯化的纤维连接蛋白(FN)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入纤维连接蛋白(FN)，再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人纤维连接蛋白(FN)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人纤维连接蛋白(FN)的含量。

纤维连接蛋白(FN)ELISA KIT

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于血清纤维连接蛋白水平对监测脓毒症患者病情变化的价值研究

研究脓毒症患者血清FN、IL-6、CRP、TNF-α的动态变化,以期寻找监测脓毒症病情变化中具意义的临床指标。

方法:收集入住福建医科大学附属协和医院重症监护病房（ICU）的脓毒症（Sepsis）、脓毒症合并多器官功能障碍（MODS）50例为感染组,其中12例单纯脓毒症,38例脓毒症合并多器官功能障碍。采集多个时间点的血清样本（相邻时间点间隔≥24小时）,以患者死亡或出院为随访终点,进行每日SOFA评分。按在院SOFA评分变化趋势分为恶化组与控制组,SOFA评分趋势上升为恶化组,降低为控制组。收集50例健康人作为对照。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清FN、CRP、IL-6、TNF-α水平。

按SOFA评分将测得的指标分为四组:1-6分组,7-12分组,13-18分组与19-24分组,非正态分布数据采用四分位数表示,组内离散度采用四分位差表示,Mann-Whiteney U比较相邻组间差异,结合SOFA评分分级评价FN、CRP、IL-6、TNF-α与脓毒症患者病情变化的动态联系及各项生物标志物的病情评估价值。

结果:1.感染组血清CRP（119.9±135.0μg/ml）显著高于健康对照组CRP（3.3±3.8μg/ml）（P<0.0001）。恶化组血清CRP（150.0±151.1μg/ml）显著高于控制组CRP（101.0±117.8μg/ml）（P<0.0001）。68.4%恶化组患者CRP逐渐升高,82.1%控制组患者CRP呈下降趋势。将SOFA评分分组后,13-18分组与19-24分组间无显著差异,其余分组组间差异明显（P<0.05）,血清CRP与SOFA评分间呈正相关关系,四组内四分位差波动于121.8-182.1ug/ml。虽然CRP与SOFA评分之间呈正相关关系,但其稀释倍数大,敏感性高,且离散程度大于FN、TNF-α,小于IL-6。

2. 感染组IL-6（468.0±902.3pg/ml）显著高于健康对照组（12.3±6.4pg/ml）。恶化组血清IL-6（678.0±1116.7pg/ml）显著高于控制组（337.0±694.5pg/ml）（P<0.0001）。66.7%恶化组患者血清IL-6浓度呈升高趋势,42.8%控制组患者血清IL-6浓度逐渐降低。将SOFA评分分组后,健康对照组与1-6分组、1-6分组与7-12分组、7-12分组与13-18分组间差异明显（P<0.0001）,13-18分组与19-24分组间无明显差异。血清IL-6与SOFA评分之间呈正相关关系。组内四分位差波动于38.3-2763.9pg/ml。IL-6水平与SOFA评分之间呈正相关,但是四分位差大,组内离散度大于CRP、FN、TNF-α。

3.血清TNF-α检出率低（60%）,感染组血清TNF-α（35.3±179.7μg/ml）显著高于健康对照组TNF-α（0.2±1.1μg/ml）（P<0.001）。恶化组血清TNF-α（9.85±54.1μg/ml）与控制组（57.6±230.8μg/ml）之间有显著差异（P=0.005）。恶化患者中29.4%呈升高趋势,病情控制者中26.9%血清TNF-α浓度呈下降趋势。SOFA评分分组后,6-12分组与13-18分组无显著差异,其余各组差异明显（P<0.05）,SOFA评分与TNF-α呈正相关关系。脓毒症合并多脏器功能衰竭组TNF-α（51.72±213.52pg/ml）显著高于单纯脓毒症组（4.23±30.34pg/ml）（P<0.05）。虽然SOFA评分与TNF-α正相关,组内四分位差波动于0-13.8ug/ml,离散度小于IL-6、CRP及FN,但TNF-α阳性率低,除19-24分组外,其余各组中位数均为0。

参考文献

[1]Prognostic value of procalcitonin（PCT）and/or interleukin-6（IL-6）plasma levels after multiple trauma for the development of multi organ dysfunction syndrome（MODS）or sepsis[J].C.Haasper,M.Kalmbach,G.D.Dikos,R.Meller,C.Müller,C.Krettek,F.Hildebrand,M.Frink.Technology and Health Care.2010(2)

[2]Cryoprecipitate:The Current State of Knowledge[J].Jeannie L.Callum,Keyvan Karkouti,Yulia Lin.Transfusion Medicine Reviews.2009(3)

[3]The Sequential Organ Failure Assessment score for predicting outcome in patients with severe sepsis and evidence of hypoperfusion at the time of emergency department presentation[J].Alan E.Jones,Stephen Trzeciak,Jeffrey A.Kline.Critical Care Medicine.2009(5)

[4]Is C-reactive protein a good prognostic marker in septic patients?[J].Joana Silvestre,P.Póvoa,L.Coelho,E.Almeida,P.Moreira,A.Fernandes,R.Mealha,H.Sabino.Intensive Care Medicine.2009(5)

[5]王怡婷.血清纤维连接蛋白水平对监测脓毒症患者病情变化的价值[D].福建医科大学,2016.