大鼠核糖核酸酶H(RNASEH)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠核糖核酸酶H(RNASEH)ELISA试剂盒用于血清、血浆、细胞上清、组织等样本中核糖核酸酶H(RNASEH)的定量检测。

大鼠核糖核酸酶H（RNASEH）酶联免疫吸附测定试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗大鼠RNASEH抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的RNASEH与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗大鼠RNASEH抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗大鼠RNASEH抗体与结合在包被抗体上的大鼠RNASEH结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物（TMB），TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，RNASEH浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中RNASEH的浓度。

大鼠核糖核酸酶H(RNASEH)ELISA试剂盒

操作步骤:

1.在各孔中加入标准品或样品各100μL，37℃孵育90分钟

2.加入100μL生物素化抗体工作液，37℃孵育60分钟

3.洗涤3次

4.加入100μL酶结合物工作液，37℃孵育30分钟

5.洗涤5次

6.加入90μL底物溶液，37℃孵育15分钟左右

7.加入50μL终止液，立即在450nm波长处测量OD值

8.结果计算

应用^[4][5]

用于重组人核糖核酸酶抑制因子对大鼠白内障的防治作用研究

人核糖核酸酶抑制因子（human ribonuclease inhibitor,hRI）是一种酸性蛋白质（pI=4.7）,广泛存在于哺乳动物细胞浆中,分子量约为50kD,其基因定位于染色体11p15.5。RI是核糖核酸酶A（ribonuclease A,RNase A）的抑制剂,可以有效地抑制其对RNA的水解活性。RI的三维结构的特征是由交替出现的α螺旋和β片层构成的马蹄形结构。RI的重复结构单元是富含亮氨酸残基的序列,这些富含亮氨酸残基的重复序列（Leucine-rich repeats,LRRs）出现在一个大的蛋白家族,该蛋白家族的显著特征是具有巨大的表面区域用于蛋白质与蛋白质间的相互作用。RI的这种独特结构和功能使其成为研究LRRs的核心蛋白。

hRI含有32个高度保守的半胱氨酸残基,其中至少有30个半胱氨酸的巯基以还原形式存在,还原型巯基是保持RI正常生物学活性所必需的。生物体内的还原型谷胱甘肽（GSH）通过其巯基对抗氧化剂,提示RI可能具有一定的抗氧化能力。糖尿病性白内障发病的机理是由于单糖氧化时产生大量的氧自由基,氧自由基可损伤晶状体蛋白和晶状体上皮细胞膜,导致蛋白变性和细胞受损而引起白内障的发生发展。

前期研究已表明RI能对抗H2O2对大鼠神经胶质瘤C6细胞的氧化损伤。本实验采用腹腔注射链脲佐菌素的方法建立了Wistar大鼠糖尿病性白内障模型;采用本室构建的pGEX-6p-1-hri融合型表达质粒转化大肠杆菌Rosetta,表达重组的GST-hRI;经培养和收集细菌、超声破碎菌体、收集离心后的上清,再经Glutathione-Sepharose 4B亲和层析分离纯化获得重组hRI。观察重组hRI对链脲佐菌素糖尿病性大鼠白内障的治疗作用。

结果表明,重组hRI可明显减缓大鼠白内障的发展进程。通过检测大鼠晶状体的各种生化指标表明,GST-hRI高剂量组GSH含量及SOD活性与正常组没有统计学差别（p>0.05）,明显高于其它组,其MDA含量则低于其它各治疗组,但高于正常组,而其GSH-PX活性与其它各组无明显差异（p>0.05）。通过检测各组动物房水中GSH含量及SOD的活性,与晶状体中对应的生化指标检测结果相一致。推测GST-hRI能对抗氧化剂,从而减少了晶状体内的氧化应激压力,避免了晶状体内各种抗氧化酶类构成的抵御氧化应激屏障的启动。

结论:1.成功的应用链脲佐菌素制备了大鼠白内障模型。2.融合蛋白GST-RI能明显延缓糖尿病性白内障的发生、发展,对链脲佐菌素性白内障有一定的防治作用,且疗效与剂量成正相关,其疗效优于白内停。3.为重组hRI的进一步应用提供了实验依据,重组hRI有可能成为防治白内障的新药。

参考文献

[1]Neutrophils in asthma:the good,the bad and the bacteria.[J].Crisford Helena,Sapey Elizabeth,Rogers Geraint B,Taylor Steven,Nagakumar Prasad,Lokwani Ravi,Simpson Jodie L.Thorax.2021

[2]Orchestration of Neutrophil Extracellular Traps（Nets）,a Unique Innate Immune Function during Chronic Obstructive Pulmonary Disease（COPD）Development[J].Trivedi Anjali,Khan Meraj A.,Bade Geetanjali,Talwar Anjana.Biomedicines.2021(1)

[3]A novel cell-based assay for dynamically detecting neutrophil extracellular traps-induced lung epithelial injuries[J].Dandan Lv,Yiming Xu,Hongqiang Cheng,Yuehai Ke,Xue Zhang,Kejing Ying.Experimental Cell Research.2020(2)

[4]Cellular Mechanisms of NETosis.[J].Thiam Hawa Racine,Wong Siu Ling,Wagner Denisa D,Waterman Clare M.Annual review of cell and developmental biology.2020

[5]刘芳君.重组人核糖核酸酶抑制因子对大鼠白内障的防治作用研究[D].大连医科大学,2007.