大鼠角膜内皮细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠角膜内皮细胞是将角膜组织酶解法制备而来，vWF、Factor VIII免疫荧光鉴定呈阳性，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

膜内皮细胞形态学上的完整和功能上的健全是临床上评价角膜功能的指标，也是角膜保存质量评定的标准。而各种角膜疾病、外科损伤以及药物毒性等都会导致角膜内皮细胞受损，当损伤超过其生理代偿时，就会发生角膜病变，严重时会导致角膜盲。为此，观察药物以及其他一些因素对角膜内皮细胞活性的影响都离不开角膜内皮细胞的体外实验，而良好的体外角膜内皮细胞分离与培养方法则是体外实验的步，其对于角膜的药理学、病理学以及角膜移植的研究具有重要的意义。

大鼠角膜内皮细胞

来源于人的角膜组织少，而且其角膜内皮细胞的分裂增殖能力低，只有在胚胎时期具有一定的增殖能力。动物实验证明，猴和兔角膜内皮细胞在体外只有有限的分裂增殖能力，而鼠的角膜内皮细胞在外伤刺激或体外培养的条件下都具有良好的增殖能力。为此，大鼠的眼球是一个用于体外培养角膜内皮细胞的重要组织来源。

目前，角膜内皮细胞的体外原代培养包括：组织块贴壁法、酶消化法(胰酶、胶原酶和dispase酶)、显微解剖法等，但是显微解剖法操作复杂；酶消化法需要严格控制酶消化时间以及酶浓度，以防止酶对细胞的损伤，而组织贴壁法则细胞迁出和生长速率较慢。而组织分离细胞培养过程中，经常会出现基质细胞污染的问题。为此，如何能通过较为简单的方法获得数量多、活性好且纯度高的角膜内皮细胞，一直是进行基础研究和临床研究亟待解决的重要问题。

应用^[4][5]

用于急性高眼压对大鼠角膜内皮细胞屏障功能及泵功能的影响研究

角膜内皮细胞对于维持角膜的相对脱水状态起着非常重要的作用,急性闭角型青光眼患者角膜水肿明显,本研究主要探讨急性高眼压（acute ocular hypertension,AOH）对大鼠角膜内皮细胞的影响。

方法:将Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为四组,穿刺对照组、AOH后即刻组、AOH后2天组、AOH后7天组。SD大鼠右眼前房灌注平衡盐液（balance salt solution,BSS）2小时建立急性高眼压模型,左眼作为正常对照。在前房灌注期间和灌注后,用手持式非接触眼压计测量大鼠眼压,裂隙灯显微镜观察各组角膜水肿情况。茜素红染色观察角膜内皮细胞形态并进行细胞计数,Ki67染色观察角膜内皮细胞的增殖情况,通过检测FITC-dextran在角膜基质中的累积量来评价角膜内皮细胞的渗透。

通过免疫荧光染色法和Westernblot检测角膜内皮细胞顶端连接复合体（ZO-1、F-actin）和Na,KATPase的改变,评价角膜内皮细胞的屏障功能和泵功能。结果:前房灌注期间眼压为82.6±2.3mmHg（正常大鼠眼压范围为:10.2±0.4 mmHg）。与对照组相比,AOH后即刻组角膜出现明显水肿,荧光渗透明显增加,周边角膜内皮细胞数量明显减少且细胞形态不规则,紧密连接蛋白（ZO-1）和细胞骨架（F-actin）均被明显破坏。Na,K-ATPase也被破坏,但表达轻微增加,没有统计学意义。AOH后2天组角膜内皮细胞增殖明显,角膜内皮细胞密度恢复至正常,F-actin被破坏得更明显,角膜水肿、周边角膜内皮细胞数量、荧光渗透,ZO-1和Na,K-ATPase均恢复正常。AOH后7天组除了F-actin尚未完全修复外角膜内皮细胞的其余各项指标均恢复正常。

结论:AOH 2小时可以破坏大鼠角膜内皮细胞的屏障功能及泵功能,是急性闭角型青光眼引起角膜水肿的原因。

参考文献

[1]Laser iridotomy and the corneal endothelium:a systemic review[J].Priscilla X.Wang,Victor T.C.Koh,Seng Chee Loon.Acta Ophthalmol.2014(7)

[2]Corneal Status in Primary Angle-closure Glaucoma With a History of Acute Attack[J].Mei-Ju Chen,Catherine Jui-Ling Liu,Ching-Yu Cheng,Shui-Mei Lee.Journal of Glaucoma.2012(1)

[3]Laser Peripheral Iridotomy With and Without Iridoplasty for Primary Angle-Closure Glaucoma:1-Year Results of a Randomized Pilot Study[J].Xia Sun,Yuan Bo Liang,Ning Li Wang,Su Jie Fan,Lan Ping Sun,Si Zhen Li,Wen Ru Liu.American Journal of Ophthalmology.2010(1)

[4]Specular Microscopy in Glaucoma Patients[J].Collegium Antropologicum.2010(2)

[5]李娴.急性高眼压对大鼠角膜内皮细胞屏障功能及泵功能的影响[D].南华大学,2016.