P19小鼠畸胎瘤细胞的应用

背景^[1-3]

P19小鼠畸胎瘤细胞是从C3H/He小鼠中诱导的恶性畸胎瘤中建立的。该细胞在含有0.1mM2-巯基乙醇的培养基中可率地克隆。该细胞具有多能性，在500nM维A酸诱导下可以分化成神经和神经胶质样细胞；在0.5%~1.0%二甲亚砜(DMSO)存在下，分化形成心脏和骨骼肌样细胞，但不形成神经或神经胶质样细胞；在DMSO和维A酸同时存在时，细胞的分化与只有维A酸一样。

P19小鼠畸胎瘤细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

用于小鼠睾丸畸胎瘤F9转移关键基因的筛选和鉴定研究

运用的全基因组随机突变技术平台,在基于piggyBac转座子的基因搜寻载体中引入了Tet-off基因表达调控系统,通过全基因组随机插入和打开或关闭基因,导致不转移或低转移的肿瘤细胞变成具有高转移能力的肿瘤细胞,从而在全基因组范围内筛选得到与这种转变具有因果关系的基因。

临床和肿瘤病理分析表明肿瘤的恶性程度与其分化程度有关,分化程度越低,恶性程度越高,转移能力也就越强。畸胎瘤细胞具有干细胞和低分化特性,多形成良性肿瘤,利用畸胎瘤和随机基因突变技术来研究控制转移的关键基因将揭示肿瘤分化与肿瘤转移的关系及其分子病理机理。

以具有干细胞特性和转移能力较低的小鼠睾丸畸胎瘤细胞F9作为模型,利用随机基因突变技术进行全基因组范围内的随机基因突变,建立了拥有109万突变细胞克隆的全基因组突变库,估计突变基因可以覆盖基因组编码基因3倍；突变细胞库分别接种小鼠皮下、腹腔和尾静脉,进而体内筛选和分离得到88株高转移细胞株；将这些高转移细胞株再次接种至动物体内,通过+/-Doxycyclin介导的基因突变和基因突变逆转,进一步体内验证转基因突变与肿瘤转移的因果关系,获得114株高转移能力的细胞株；通过Splinkerette PCR基因克隆和测序分析基因搜寻载体插入位点和突变类型,确认有32个基因突变与小鼠F9睾丸畸胎瘤细胞转移有因果关系,其中有已知在肿瘤转移中发挥重要作用的基因,如Smad1、Tgfbr3、Ccnd3等,大部分基因在肿瘤转移中的作用未见报道,包括WDR44、TSC22D1等基因。

这些基因中Smad1、Tgfbr3、TSC22D1等多个基因都属于与肿瘤转移有重要关联的TGFβ信号通路,其中TSC22D1处于该信号通路的下游,直接作用于效应蛋白发挥转录抑制因子的作用,从而调控细胞生长、衰老、更新和分化,因此为进一步研究TGFβ信号通路在肿瘤转移中的分子病理机制提供了新的切入点,为临床上恶性肿瘤的诊断和治疗提供了潜在的生物标志物和靶点。

参考文献

[1]Cancer statistics,2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths.[J].Siegel Rebecca,Ward Elizabeth,Brawley Otis,Jemal Ahmedin.CA:a cancer journal for clinicians.2011(4)

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[3]Antagonistic TSC22D1 variants control BRAF（E600）-induced senescence.[J].H?mig-H?lzel Cornelia,van Doorn Remco,Vogel Celia,Germann Markus,Cecchini Marco G,Verdegaal Els,Peeper Daniel S.The EMBO journal.2011(9)

[4]Development of the piggyBac transposable system for Plasmodium berghei and its application for random mutagenesis in malaria parasites.[J].Fonager Jannik,Franke-Fayard Blandine M D,Adams John H,Ramesar Jai,Klop Onny,Khan Shahid M,Janse Chris J,Waters Andrew P.BMC genomics.2011(1)

[5]卞晓翠.小鼠睾丸畸胎瘤F9转移关键基因的筛选和鉴定[D].北京协和医学院,2012.