小鼠T淋巴细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠T淋巴细胞是骨髓来源的淋巴干细胞在胸腺内分化而成的。胸腺发育成熟的T细胞转移到外周淋巴器官或淋巴组织，在没有接触特异性抗原分子刺激前，保持相对静息状态，称初始T细胞。一旦接受相应抗原的刺激，它们便转化为代谢活跃、直径为15~20μm的大淋巴细胞，并增殖分化。大部分分化为效应性T细胞，获得了迁移、产生细胞因子和其他效应的功能，小部分形成记忆性T细胞。效应性T细胞寿命较短，具有杀伤靶细胞的功能。记忆性T细胞寿命可长达数年，甚至终身，当机体再次遇到相同抗原刺激时，能迅速转化增殖，形成大量效应性T细胞，启动更大强度的免疫应答，并使机体较长时期保持对该抗原的免疫力。由于效应性T细胞可直接杀灭靶细胞，故T细胞参与的免疫称为：细胞免疫。

小鼠T淋巴细胞

T细胞(小鼠T淋巴瘤细胞)是相当复杂的异质性细胞群体。按其在免疫应答中的功能不同，可将T细胞分为：以下三个亚群。

①细胞毒性T细胞：简称Tc细胞，占T细胞总数的20~30%，它们能直接攻击进入体内的异体细胞、带有变异抗原的肿瘤细胞和病毒感染的细胞等。Tc细胞接触靶细胞后，能够释放颗粒酶和穿孔素，诱发靶细胞凋亡。

②辅助性T细胞：简称Th细胞，占T细胞(小鼠T淋巴瘤细胞)总数的50~70%，能够分泌多种细胞因子，辅助Tc和B细胞行使免疫应答功能。艾滋病病毒能特异性破坏Th细胞，导致患者免疫系统瘫痪。

③调节性T细胞：简称Tr细胞，数量较少，能够抑制免疫应答，使免疫应答的程度不至于过于强烈。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO，货号11965-092)，90%；马血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM，常温条件下离心5分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，吹打均匀后，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO摇匀后进行冻存。

应用^[4][5]

用于肠毒素SEC2非MHCⅡ依赖型突变体激活小鼠T淋巴细胞信号机制的研究

在SEC2及其突变体ST-4有效诱导BALB/c小鼠脾细胞活化过程中,伴随着p70S6K、cyclin E、cyclin D3和NF-κB/p65的基因转录水平和蛋白表达上调,而p27kip基因转录水平和蛋白表达下调。与SEC2相比,ST-4表现出更强的激活PT3K/mTOR和NF-κB信号活化能力。

其次,SEC2及ST-4诱导IL-2分泌与p65活化呈正相关,并有显著的时间依赖和剂量依赖性。P13K抑制剂LY294002,mTOR抑制剂Rapmycin和NF-κB抑制剂Bayll-7085能够显著抑制SEC2及ST-4诱导的小鼠脾细胞增殖、CD69/CD25细胞表型表达、细胞周期进程和IL-2的分泌。LY294002和Rapamycin显著抑制由SEC2及ST-4诱导PI3K/mTOR细胞周期信号通路的活化;Bayll-7085则显著下调了SEC2及ST-4诱导的NF-κB/p65活化。

提示PI3K/mTOR和NF-κB信号通路参与了SEC2及ST-4诱导的T细胞活化。PKCθ在T细胞活化过程中,通过独特的方式交联TCR信号,进而激活NF-κB信号通路诱导IL-2产生。本研究采用特异性抑制剂、siRNA和封闭抗体,探究SEC2及ST-4通过NF-κB和IL-2激活脾细胞的详细机制。研究发现,在SEC2及ST-4诱导的脾细胞分泌IL-2细胞因子过程中,显著上调PKCθ、IKKα/β、IκBα和NF-κB蛋白。

进一步以IL-2封闭抗体实验结果表明,由SEC2及ST-4诱导的T细胞活化,是基于IL-2诱导的IL-2R/STAT5信号通路激活。提示PKCθ/NF-κB和IL-2R/STAT5信号通路,参与了SEC2及ST-4诱导的T细胞活化。肠毒素对MHCⅡ分子的依赖性,可能受肠毒素和TCR之间作用的调节,提示改变肠毒素与TCR的亲合力,可能影响对MHCⅡ分子的依赖性。

采用免疫磁珠,从脾淋巴细胞中分离出不含MHCⅡ分子的纯化的CD4+T细胞,探究ST-4在无MHCⅡ分子下刺激T细胞活化能力。研究发现,在无MHCⅡ分子的情况下,与SEC2相比,ST-4仍可诱导CD4+T细胞增殖及TCR Vβ8.2和8.3亚型的转录,表明ST-4能够不依赖MHCⅡ分子而激活T细胞。进一步研究发现,在无MHCⅡ分子条件下,ST-4可通过PKCθ/NF-κB信号通路活化CD4+T细胞,而SEC2不能激活该信号通路。

PKCθ蛋白酶抑制剂AEB071,可显著抑制由ST-4诱导的CD4+T细胞增殖、CD69/CD25细胞表型表达、IL-2的分泌和PKCθ/NF-κB信号通路蛋白活化。进一步的siRNA干扰和抗体封闭实验结果显示,ST-4非MHCⅡ依赖性激活CD4+T细胞的过程,是基于IL-2诱导的IL-2R/STAT5信号活化,并被Lck所调控。综上所述,本研究证明,PI3K/mTOR、PKCθ/NF-κB和IL-2R/STAT5信号通路,参与了SEC2及ST-4诱导的T细胞活化。

与SEC2相比,ST-4表现出更强的PI3K/mTOR、PKCθ/NF-κB和IL-2R/STAT5信号活化能力,最终导致了增强的T细胞活化能力。ST-4可在无MHCⅡ分子条件下,通过增强的PKCθ/NF-κB和IL-2R/STAT5信号通路,非MHCⅡ依赖性的刺激CD4+T细胞活化。

参考文献

[1]Ionic CD3-Lck interaction regulates the initiation of T-cell receptor signaling.[J].Li Lunyi,Guo Xingdong,Shi Xiaoshan,Li Changting,Wu Wei,Yan Chengsong,Wang Haopeng,Li Hua,Xu Chenqi.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2017(29)

[2]Time-Dependent Regulation of IL-2Rα-Chain（CD25）Expression by TCR Signal Strength and IL-2-Induced STAT5 Signaling in Activated Human Blood T Lymphocytes.[J].Shatrova Alla N,Mityushova Elena V,Vassilieva Irina O,Aksenov Nikolay D,Zenin Valery V,Nikolsky Nikolay N,Marakhova Irina I.PloS one.2016(12)

[3]Dynamic Regulation of TCR-Microclusters and the Microsynapse for T Cell Activation.[J].Hashimoto-Tane Akiko,Saito Takashi.Frontiers in immunology.2016

[4]Up-regulation of granzyme B and perforin by staphylococcal enterotoxin C2 mutant induces enhanced cytotoxicity in Hepa1–6 cells[J].Guojun Zhang,Mingkai Xu,Huiwen Zhang,Yubo Song,Jian Wang,Chenggang Zhang.Toxicology and Applied Pharmacology.2016

[5]付煊赫.肠毒素SEC2非MHCⅡ依赖型突变体激活小鼠T淋巴细胞信号机制的研究[D].沈阳药科大学,2018.