碱性蛋白酶的应用

背景及概述^[1][3]

碱性蛋白酶（Alkaline Protease）属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在 碱性条件下水解蛋白质肽键，其最适作用pH一般为9~11，主要应用于加酶洗涤 剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。该酶种最早在猪的胰脏中发现。

目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶中用得最多的一种酶，约占酶总量的60%，其中碱性蛋白酶就占25%。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。碱性蛋白酶又称丝氨酸蛋白酶。

一类最适pH在9～11范围的蛋白酶。常见的有两种，一为Novo蛋白酶，另一为Carsberg蛋白酶，两者的性质和构造相近，分别含275和274个氨基酸残基，由一条多肽链构成。在pH6～10下稳定，低于6 或大于11时很快失活。其活性中心含丝氨酸，故称丝氨酸蛋白酶。当遇可作用于丝氨酸的试剂-二异丙基氟磷酸(DFP)时即失活。对金属螯合剂 EDTA、重金属和巯基试剂不敏感，Ca²⁺对酶的稳定有利，耐热性强，在55℃下 放置30min仍保持大部分活力，故适宜作为洗涤剂酶。

本酶作用位置要求在水解点的羧基侧具有芳香族或疏水性氨基酸，如酪氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸等。除上述两种外，另有一种较新的种类，来自嗜碱性的芽孢杆菌(Bacillus sp)，最适pH为12，在pH5～12范围内极为稳定，故十分适用于洗涤剂要求。

产碱性蛋白酶的微生物有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆 菌(B. amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、嗜碱芽孢杆菌(B. alcalophilus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、弗氏链霉菌(S.fradiae)和某些镰孢霉(Fusarium spp)等。在我国，多选用地衣芽孢杆菌“2709”菌株和短小芽 孢杆菌“289”、“209”菌株生产碱性蛋白酶。

制剂^[2]

碱性蛋白酶微胶囊粉：

将海藻酸钠与蒸馏水按照2.3∶100g/mL的比例用磁力搅拌器进行混合均 匀，搅拌温度为20℃，搅拌时间为2h，转速为800r/min。接着，将碱性蛋白酶固体粉末与蒸馏水按照1.15∶100g/mL的比例用磁力搅拌器进行混合均匀，搅拌温度为20℃，搅拌时间为10min，转速为700r/min。然后，将CaCl₂固体粉末与蒸馏水按照2∶100g/mL的比例用磁力搅拌器进行混合均匀，搅拌温度为20 ℃，搅拌时间为2min，转速为700r/min。

将壁材溶液与芯材溶液按照体积比为1∶1的比例用磁力搅拌器混合均匀，搅拌温度为20℃，搅拌时间为5min，转速为 800r/min。采用50mL注射器吸入40mL的已混合均匀的壁材芯材溶液，放置于 注射泵上，设定微胶囊造粒机的泵流量为5.01mL/min，微量搅拌器转速为40%， 电极电压为1550V，振动频率为1900Hz，锐孔孔径为200μm的条件下，将包埋好的微胶囊喷射到固定液CaCl₂中。

待造粒过程结束，将已均匀分散到CaCl2固定液中的微胶囊静置1h，使其充分沉淀、固定成型。将含有碱性蛋白酶微胶囊 的固定液进行真空抽滤，其中真空水循环泵的工作条件为功率180W，电压 220V，流量60L/min，扬程8M，真空度0.098Mpa，单头抽气量10L/min， 抽滤完成后收集滤纸上的微胶囊颗粒。

将收集好的碱性蛋白酶微胶囊分装到冷冻 盘中，物料厚度为8mm，放置在条件为-80℃冷冻库中预冻5h；然后将冷冻盘在-55℃的条件下真空冷冻干燥24h，然后进行成品包装，得到粒径为2000微米、含水量为8%、包埋率为90.424%的微胶囊粉。

制备^[4]

CN201210144483.3提供一种生产碱性蛋白酶的方法，这种碱性蛋白酶适合于生产大豆肽。本发明采用如下技术方案：一种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，其生产关键技术如下；选用高地芽孢杆菌为碱性蛋白酶发酵菌种，采用培养基配方为每升液体培养基含有：豆粕40‑80克，蔗糖30‑70克，吐温‑800. 3‑0. 7克，葡萄糖20克，氯化钙 0. 7克，硫酸镁 0. 4克，氯化钾 0. 3克。

发酵条件为：培养温度为37°C，初始pH值为pH10.0，搅拌速度300 rpm，充气速度1vvm，发酵时间3天。发酵液再经过压滤机过滤、超滤浓缩、添加稳定剂和防腐剂，包装后即为商品碱性蛋白酶。本发明生产的碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白得到的大豆肽产品具有如下特性：通过高效液相色谱法分析，大豆肽分子量分布为：分子量MW≤1000 Da的短肽占80.7%，MW≤2000 Da的肽占91%。产品符合国家标准（GB/T22492‑2008）中的大豆肽一级标准。大豆肽分子量分析参照QB/T22492‑2008方法，结果见附图1。

应用^[5-6]

一、利用碱性蛋白酶催化水解蛋白质制备发泡剂母液

发泡剂是制备气泡混合轻质土以及泡沫混凝土等土木工程轻质材料的必备原材料，发泡剂性能的优劣是影响气泡混合轻质土以及泡沫混凝土性能的决定性因素，而制备性能优良的复合型发泡剂需要先制备发泡剂母液。

CN201811148311.7提供一种利用碱性蛋白酶催化水解蛋白质制备发泡剂母液的方法，该方法可以催化水解原料蛋白，显著减少水解时间，解决了现有碱水解、酸水解和盐水解等方法水解效率低的问题。该方法包括以下步骤：1)将原料蛋白、碱性蛋白酶和水置于容器中搅拌均匀得到混合液，并调节pH值至9～13；2)将步骤1)得到的混合液加热保温反应，反应一定时间后重新调节pH值至9～13，重复数次即可制得到发泡剂母液。

二、提取虾壳蛋白

虾壳中蛋白质的提取主要是利用酸除去虾壳中的钙，然后用碱将虾壳中的 蛋白质提取出来，调节提取液pH，使蛋白质沉淀析出，或用盐析法将蛋白质回收。另一种方 法是使用蛋白酶将虾壳中的蛋白质水解出来，所得水解液可以进一步调配制成虾油，或者 经喷雾干燥制成蛋白粉。

用碱法提取蛋白的过程中会带来严重的环境污染，而单纯用酶法 来水解蛋白质由于酶的不能回收利用，也存在着严重的浪费。CN201710186400.X提供了一种利用磁性固定化碱性蛋白酶 提取虾壳蛋白的方法，该方法简单易操作，稳定性好，水解蛋白效果好，提取所需成本低。包括如下步骤：

1、制备磁性固定化碱性蛋白酶：

1.1、将磁性壳聚糖微球加入pH＝9-12的硼砂缓冲液中，再加入碱性蛋白酶，磁性 壳聚糖微球、碱性蛋白酶和硼砂缓冲液的比例为1mg:100-400U:0.1-1ml，在0-10℃下反应 2-5h，得到混合产物；

1.2、向混合产物中加入戊二醛，使戊二醛的终浓度为0.005-0.01g/ml，在0-10℃ 下反应2-5h，过滤，将滤渣用硼砂缓冲液洗涤，干燥，得到磁性固定化碱性蛋白酶；

2、提取虾壳中的蛋白：

2.1、将虾壳粉加入到浓度为50-90g/L乙酸溶液中，虾壳粉与乙酸溶液的质量体积 比为1g:6-14ml，在55-75℃下反应1-5h，得混合液；

2.2、将混合液过滤，向滤渣中加入碱性溶液至体系呈中性，过滤，再用蒸馏水洗涤 滤渣，干燥，得改性虾壳粉；

2.3、测定改性虾壳粉中虾壳蛋白的含量；

2.4、将改性虾壳粉加入到pH为9-12的硼砂缓冲液中，接着加入磁性固定化碱性蛋 白酶(磁性固定化碱性蛋白酶的活性可以通过Folin-酚法进行测定)，磁性固定化碱性蛋白 酶与虾壳蛋白的比例为10-20U:1mg，在温度为45-60℃下搅拌酶解1-5小时，酶解结束后，用 吸铁石分离出磁性固定化碱性蛋白酶，将分离出的磁性固定化碱性蛋白酶洗涤后保存备 用，再将所得的酶解液过滤，将滤液进行冷冻干燥，得到虾壳蛋白多肽，即为虾壳蛋白粉

主要参考资料

[1] 微生物学词典

[2] CN201410083413.0 一种碱性蛋白酶微胶囊粉及其制备方法

[3] CN201210417021.4 碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶

[4] CN201210144483.3 一种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法

[5]CN201811148311.7 利用碱性蛋白酶催化水解蛋白质制备发泡剂母液的方法

[6]CN201710186400.X 一种利用磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法