重组大鼠CINC-1/CXCL1的应用

背景^{[1][2][3][4][5]}

趋化因子配体1（CXCL1）是一个小细胞因子属于CXC趋化因子，中性粒细胞激活蛋白3（NAP-3）和黑素瘤生长可激活CXCL1活性，在人类机体中，这种蛋白质由Cxcl1编码。CXCL1由人黑素瘤细胞分泌，具有促有丝分裂特性并且与黑素瘤发病机理有关。CXCL1由巨噬细胞，中性粒细胞和上皮细胞表达，并具有中性粒细胞化学引诱物活性。

CXCL1通过抑制少突胶质细胞前体的迁移在脊髓发育中发挥作用，并参与血管生成，动脉发生，炎症，伤口愈合和肿瘤发生。这种趋化因子通过趋化因子受体CXCR2发出信号，从而引发其作用。CXCL1的基因位于人类第4号染色体上，用于其他CXC趋化因子的基因。

鼠的初步研究表明，CXCL1可降低多发性硬化的严重程度，并可能提供神经保护功能。RecombinantRatCINC-1/CXCL1是通过基因工程技术将CXCL1的基因构建到大肠杆菌中并诱导CXCL1大量表达最后通过层析纯化制得。

临床应用^[6][7]

1.Recombinant Rat CINC-1CXCL1主要用于脊柱关节病外周关节炎及病因相关性研究。

在趋化因子CXCL1与脊柱关节病外周关节炎及病因相关性研究中应用ELISA技术分别检测54例强直性脊柱炎(AS)患者和30例健康者(正常对照组)外周血CXCL1的蛋白表达水平;比较33例SpA和14例骨关节炎(OA)患者关节液中CXCL1的表达水平,同时还检测生物制剂英利昔单抗治疗前后CXCL1的蛋白表达水平。

结果在关节液刺激后,基因芯片筛选出PBMC中的CXCL1、CXCL2、CXCL3和IL-8基因表达增高2倍以上,炎性细胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1等)和其他趋化因子的表达并未随关节液的刺激而增加;ELISA结果发现AS患者外周血中CXCL1的蛋白水平显著高于正常对照组(P<0.01);SpA患者关节液中的CXCL1蛋白表达水平也显著高于OA患者(P<0.01)。结论CXCL1在诱导脊柱关节病外周关节炎症和在脊柱关节病的发病机制中发挥一定的作用。

2.趋化因子CXCL1在骨癌性疼痛中的作用及其机制研究。

骨癌痛是癌症病人最常见的一种疼痛,也是肿瘤发生骨转移时最常见的症状之一。趋化因子是一类特殊的细胞因子,在介导免疫功能、炎症反应、伤口愈合、同种异体移植物的排斥等方面发挥重要作用。在研究骨癌性疼痛模型中趋化因子CXCL1及其受体CXCR2在小鼠脊髓和背根神经节(DRG)中的表达变化和细胞分布,探讨它们在骨癌性疼痛中的调制作用。方法单侧股骨内注射前列腺癌细胞RM-1(1x106)诱导小鼠产生骨癌性疼痛。

用机械刺激和热辐射刺激检测小鼠注射RM-1后不同时间点机械性触诱发痛和热痛觉过敏的变化以及自发痛的变化。取小鼠脊髓腰膨大L4-5段和注射侧背根神经节(DRG),通过实时荧光定量PCR检测CXCL1和CXCR2mRNA表达变化,免疫荧光和Western Blot方法分别检测CXCL1和CXCR2蛋白表达变化,免疫荧光双标检测CXCL1和CXCR2在脊髓中表达的细胞类型。

应用实时荧光定量PCR和ELISA方法检测炎症因子TNF-a刺激体外培养星形胶质细胞表达CXCL1的变化以及NFκB对CXCL1表达量的影响。脊髓鞘内注射CXCL1中和抗体、NFκB抑制剂BAY11-7082以及CXCR2拮抗剂SB225002,行为学检测其对机械性触诱发痛和热痛敏反应的影响。

结果(1)注射前列腺癌细胞RM-1的股骨在14d出现明显的骨质破坏以及癌细胞的侵入性增殖。(2)股骨内注射前列腺癌细胞诱导小鼠产生了明显的机械性触诱发痛和热痛觉过敏以及自发痛,从注射后7d开始出现,维持21d以上,表明骨癌痛模型制作成功。(3)骨癌痛模型诱导脊髓中CXCL1mRNA和蛋白表达上调：mRNA和蛋白的上调均从7d开始,维持21d以上；免疫荧光双标显示CXCL1主要与星形胶质细胞标记物GFAP共标,而不与小胶质细胞的标记物CD11b或神经元的标记物NeuN共存。

(4)体外培养的星形胶质细胞在TNF-a刺激下,CXCL1表达增多；外源性给予NFκB抑制剂BAY11-7082预处理后,TNF-α诱导的星形胶质细胞中CXCL1表达下调。(5)骨癌痛模型诱导P-NFκB在脊髓表达升高；免疫荧光双标显示P-NFκB主要表达在脊髓星形胶质细胞中。(6)骨癌痛模型诱导DRG中CXCL1mRNA和蛋白表达上调：mRNA和蛋白的上调一致,从7d开始,维持21d以上。(7)脊髓鞘内注射CXCL1中和抗体或BAY11-7082能够缓解骨癌诱导产生的机械痛敏和热痛敏反应。

(8)骨癌痛模型诱导CXCR2在脊髓表达升高：CXCR2mRNA升高见于癌细胞注射后7d、14d、21d；蛋白表达从7d开始显著升高；免疫荧光双标显示CXCR2与神经元的标记物NeuN双标,即表达于脊髓神经元中。(9)骨癌痛模型诱导DRG中CXCL1的主要受体CXCR2表达升高：CXCR2的mRNA在癌细胞注射后7d、14d、21d显著升高；同样地免疫荧光单标显示CXCR2蛋白在7d、14d、21d有显著升高。(10)脊髓鞘内注射CXCR2受体拮抗剂SB225002能够缓解骨癌诱导产生的机械痛敏和热痛敏反应。

结论小鼠股骨内注射前列腺癌细胞RM-1能诱导骨癌性疼痛并伴随趋化因子CXCL1及其受体CXCR2在脊髓和DRG中表达增加。在脊髓,CXCL1和CXCR2通过介导星形胶质细胞和神经元的相互作用参与骨癌症性疼痛的调节。靶向CXCL1-CXCR2的功能可能是治疗骨癌症性疼痛的有效方法。 

参考文献

1. Haskill S,Peace A,Morris J,Sporn SA,Anisowicz A,Lee SW,Smith T,Martin G,Ralph P,Sager R(October 1990)."Identification of three related human GRO genes encoding cytokine functions".Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(19):7732–6.doi:10.1073/pnas.87.19.7732.PMC54822.PMID2217207.

2. Anisowicz A,Bardwell L,Sager R(October 1987)."Constitutive overexpression of a growth-regulated gene in transformed Chinese hamster and human cells".Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(20):7188–92.doi:10.1073/pnas.84.20.7188.PMC299255.PMID2890161.

3. Richmond A,Thomas HG(February 1988)."Melanoma growth stimulatory activity:isolation from human melanoma tumors and characterization of tissue distribution".J.Cell.Biochem.36(2):185–98.doi:10.1002/jcb.240360209.PMID3356754.

4. ida N,Grotendorst GR(October 1990)."Cloning and sequencing of a new gro transcript from activated human monocytes:expression in leukocytes and wound tissue".Mol.Cell.Biol.10(10):5596–9.PMC361282.PMID2078213.

5. Becker S,Quay J,Koren HS,Haskill JS(March 1994)."Constitutive and stimulated MCP-1,GRO alpha,beta,and gamma expression in human airway epithelium and bronchoalveolar macrophages".Am.J.Physiol.266(3 Pt 1):L278–86.PMID8166297.

6. 趋化因子CXCL1在骨癌性疼痛中的作用及其机制研究[D]. 徐洁.南通大学 . 2013

7.  趋化因子CXCL1与脊柱关节病外周关节炎及病因相关性研究[J]. 杨春花,黄烽.解放军医学杂志 . 2007 (04)