新西兰小牛血清的应用

背景^[1-3]

新西兰小牛血清是购自世界著名动物血清生产商的进口分装产品，产地新西兰。小牛血清用于常规的细胞培养时，溶解后直接倒入500ml的DMEM等细胞培养基中，混匀后即可使用。

新生牛血清所用的新生牛年龄都不超过14天，并且所有血源都是由无疯牛病区域的屠宰场所提供。从血液收集到最终产品检验和审核的每一个步骤，都采用专用设备和标准操作程序，保证高品质和各批次的一致性。

新生牛血清符合新西兰的FDA质量体系要求，pH值、渗透压、血红蛋白浓度、内毒素水平、总蛋白等多项指标检测合格，无细菌、真菌、支原体及病毒污染，具有高质量和高稳定性。

新西兰小牛血清

瓶装血清解冻需采用缓慢解冻法：把在-15~-40℃低温冰箱中保存的血清放入4℃冰箱中解冻约1天，待全部解冻后再分装。在解冻过程中每隔约2小时可轻轻摇晃均匀(尽量避免产生气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃或更低温度进入37℃水浴解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀，从而使用血清的质量下降。

血清中的絮状沉淀物主要是解冻后血清中纤维蛋白及4℃长时间保存后血清中的脂蛋白变性造成的，这些絮状物不会影响血清本身的质量，可不用处理。如果必须要处理，可400g离心5分钟去除。但不宜过滤去除，因为絮状物可能阻塞滤膜。

应用^[4][5]

用于CREG抑制动脉粥样硬化血管平滑肌细胞表型转化及其分子机制的研究

探讨CREG在AS发生、发展中对VSMC表型转化的调控作用和分子机制。

方法:1.标本（1）人的AS血管来源于截肢手术的糖尿病病人,正常血管来源于器官捐赠者。（2）新西兰大白兔给予正常喂养和高脂喂养1月或者2月。高脂饲料:1%胆固醇,10%脂肪,10%蛋黄粉。白兔麻醉后取主动脉根部血管。（3）apoE（-/-）小鼠购自北京大学动物实验中心,8周龄断奶后给予高脂喂养（添加21%脂肪和0.25%胆固醇）。

2. 免疫组化和免疫荧光染色（1）石蜡切片的免疫组化:组织分离后,PBS清洗,浸入4%福尔马林溶液,4℃过夜。固定的组织按酒精梯度脱水,石蜡包埋。切成5μm厚的切片,烤箱烘干后脱蜡,按梯度酒精复水。切片用3%甲醛过氧化氢孵育30min,去除内源性过氧化物酶。然后在室温下用4%小牛血清（BSA）孵育60min,阻断非特异性抗体。加入1:100的一抗（抗CREG,SMαactin,SM MHC和CD31抗体）,4℃过夜;PBS清洗后加入1:150稀释的二抗90min,PBS清洗后用0.05%DAB染色2min,苏木素复染,脱水、透明后封片。光学显微镜照相。

（2）冰冻切片的免疫荧光:组织分离后于4%多聚甲醛浸泡30min,7.5%蔗糖PBS脱水过夜。将组织包埋于OCT中冷冻,而后切成5μm的冰冻切片,3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶;4%BSA封闭后加入一抗及带有荧光标记的二抗,在荧光显微镜下观察,拍照。

3. VSMC培养VSMC来源于心脏移植手术中人的非AS动脉,经胰酶消化后的VSMC在10%胎牛血清（FCS）DMEM中培养传3-5代。VSMC经传代后种植于0.4%FCS的DMEM中培养48h,添加100μg/mL oxLDL刺激不同时间点。如果用阻断剂时,将ERK阻断剂提前加入细胞培养皿中,30min后给予100μg/mL oxLDL刺激。

4. 蛋白纯化和western blot分析细胞和组织匀浆在裂解液中裂解后,15 000g离心10min收集上清,测定总蛋白浓度。蛋白经浓缩胶、分离胶电泳后,转移至PVDF膜。加入一抗及带有HRP的二抗,添加ECL试剂盒中的荧光剂,曝光显影。

5. AS斑块定量分析将HE染色及油红染色的照片经Image-pro plus 6.0软件系统分析,计算斑块面积所占的百分比。

6. ELISA分析上清中的TNF-α和IL-1β细胞经oxLDL刺激后,在指定时间点收集上清,按ELISA试剂盒说明书操作,定量分析TNF-α和IL-1β含量。

结果:1.CREG在AS血管中表达下调（1）新西兰白兔高脂喂养1-2月,动脉血管行免疫组化染色,发现高脂喂养1月时血管内膜开始增厚,内膜细胞增生活跃。与对照组相比,VSMC标志蛋白SMα-actin和SM MHC表达下降,同时CREG表达也下调。Western blot分析显示,与正常对照组相比较,CREG在高脂喂养的AS血管中表达明显下调。（2）在人的AS血管中,CREG无论在内膜还是在中膜,表达均明显下降,同时VSMC标志物SMα-actin和SM MHC也下降。（3）在apoE（-/-）小鼠高脂喂养2周内,CREG在动脉血管中的表达不是降低,而是明显升高,高脂喂养第4周CREG表达急剧下降,而后又逐渐上升,但不能升至正常水平。同时核转录因子NF-κB随着时间的推移,表达逐渐升高。

2. oxLDL刺激VSMC下调CREG,过表达CREG抑制VSMC增殖（1）oxLDL刺激VSMC12~24h后,CREG蛋白表达降低,同时SMα-actin和SM MHC表达也下降,P-ERK1/2表达却上调。在CREG低表达组（CREG-DOWN）细胞给予ERK阻断剂PD98059（50μmol/L）后再添加oxLDL,细胞增殖受到抑制。经oxLDL刺激24h,CREG正常表达（CREG-NR）组的细胞数量明显多于CREG高表达（CREG-UP）组,而CREG-DOWN组细胞数量又明显高于CREG-NR组。Brdu阳性细胞数在CREG-DOWN组最多,其次为CREG-NR组,CREG-UP组最少。这表明:CREG过表达明显抑制VSMC增殖,而CREG低表达则促进了VSMC的增殖。

3.CREG过表达抑制NF-kB p65核转位,降低了TNF-α和IL-1β分泌（1）在三组细胞中,血清饥饿后添加100μg/ml oxLDL刺激12~24h,提取核蛋白后行western blot检测NF-kB p65。在CREG-NR组细胞中,核内NF-kB表达明显增多,在CREG-UP组细胞中NF-kB表达仅轻度上升,而CREG-DOWN组细胞中,NF-kB表达明显高于其他两组,均有显著差异（P<0.05）。同时应用ELISA方法检测三组上清中分泌TNF-α和IL-1β的变化。经刺激24h,三组细胞分泌的TNF-α和IL-1β有明显差异,CREG-UP组细胞上清中分泌TNF-α和IL-1β明显少于其他两组（P<0.05）。

参考文献

[1]Differential expression of oxidized/native lipoprotein（a）and plasminogen in human carotid and cerebral artery plaques[J].Takahiko Umahara,Toshiki Uchihara,Shingo Yamada,Takao Hashimoto,Jiro Akimoto,Jo Haraoka,Toshihiko Iwamoto.Atherosclerosis.2011(2)

[2]Smooth Muscle Cell-Specific Insulin-Like Growth Factor-1 Overexpression in Apoe?/?Mice Does Not Alter Atherosclerotic Plaque Burden but Increases Features of Plaque Stability[J].Shaw-Yung Shai,Sergiy Sukhanov,Yusuke Higashi,Charlotte Vaughn,James Kelly,Patrice Delafontaine.Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology.2010(10)

[3]Overexpressing cellular repressor of E1A-stimulated genes protects mesenchymal stem cells against hypoxia-and serum deprivation-induced apoptosis by activation of PI3K/Akt[J].Jie Deng,Yaling Han,Chenhui Yan,XIaoxiang Tian,Jie Tao,Jian Kang,Shaohua Li.Apoptosis.2010(4)

[4]Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor–Deficient Mice[J].Mu Qiao,Qingwei Zhao,Chi Fung Lee,Lisa R.Tannock,Eric J.Smart,Richard G.LeBaron,Clyde F.Phelix,Yolanda Rangel,Reto Asmis.Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology.2009(11)

[5]杨桂棠.CREG抑制动脉粥样硬化血管平滑肌细胞表型转化及其分子机制的研究[D].大连医科大学,2011.