真核肽链释放因子1抗体的应用

背景^[1-3]

真核肽链释放因子1抗体是可以特异性真核肽链释放因子1的多克隆抗体，主要用于体外检测真核肽链释放因子1的免疫学实验。

在大多数生物中，64个密码子中的三个（UAA，UAG和UGA）用作翻译终止信号，称为终止密码子（termination codon），也叫无义密码子（nonsense codon）。与有义密码子不同，终止密码子的识别不依赖于tRNA，而是通过I类释放因子进行的。

参与翻译起始的蛋白因子称为起始因子，参与延伸的叫延伸因子（eIF5A除外）。而参与翻译终止的因子换了个名字，叫做释放因子（release factor，RF）。这是因为它们参与新生肽链的释放过程。

真核肽链释放因子1抗体

释放因子分为两类，I类因子负责终止密码子识别和肽基tRNA水解。II类因子具有GTP酶活性，可以辅助I类因子进入PTC（肽基转移酶中心）。

原核生物的I类释放因子是RF1和RF2，前者识别UAA和UAG，后者识别UAA和UGA。真核生物和古细菌都只有一个I类因子，真核的叫做eRF1，古细菌的叫aRF1。eRF1和aRF1彼此同源，但是与细菌的几乎没有序列同源性。

释放因子（release factor，RF）：识别终止密码子引起完整的肽链和核糖体从mRNA上释放的蛋白质。单一因子以数字排列，真核生物细胞的因子称为eRF/RF。

释放因子使多肽链与tRNA之间的酯键水解，释放多肽链，消耗GTP。

eRF1：真核生物的释放因子，能识别所有三种终止密码子（UAA、UAG、UGA）。因为它没有与GTP结合的位点，所以它不能帮助完成合成多肽从P位点的tRNA的释放。大部分真核生物只含eRF1。

应用^[4][5]

用于eRF1的C端结构域在终止密码子识别过程中的功能研究

首先构建了四膜虫（Tetrahymena thermophilia）eRF1的N结构域与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1（Tt/Sc eRF1,Tt/Sp eRF1）。

利用双荧光素酶报告体系检测结果证实,两种杂合的eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显著差异。Tt/Sc eRF1识别终止密码子UGA,而不识别UAA和UAG终止密码子,与四膜虫eRF1一致,表现出了密码子识别特异性（对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是1.98%、3.83%、11.04%）;而Tt/Sp eRF1可以识别三个终止密码子,无密码子识别特异性（对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是2.81%、2.01%、1.88%）。

由此说明四膜虫eRF1的N结构域不是决定其识别特异性的唯一因子,在eRF1的M和C结构域中可能存在决定eRF1识别性质的元件或细胞中其它因子可能通过M和C结构域参与eRF1识别终止密码子的过程。为解释这一现象,我们将Sp eRF1的C端小结构域中氨基酸进行突变,选择了其中的第357、361、364和367位的氨基酸突变为酿酒酵母eRF1相应的位点,得到一系列的突变体（Tt/Sp eRF1 A364Q、Tt/Sp eRF1 D361A/A364Q、Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q、Tt/Sp eRF1L357A/D361A/A364Q/E367D）。

同样也将裂殖酵母eRF1的364、367和371位氨基酸引入酿酒酵母eRF1,得到突变体Tt/Sc eRF1 Q364A、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E/E371S。结果显示,所有的突变体对UGA的识别效率没有明显的变化,但是Tt/Sp eRF1的突变体对UAG和UAA的通读效率显著提高,说明其对这两个密码子的识别效率降低。而Tt/Sc eRF1的突变体,对终止密码子识别活性的影响不显著,其对UAG的识别活性稍有提高,通读效率从5.77%降至2.98%,以上结果表明C端小结构域影响到eRF1对UAG和UAA密码子的识别活性。

为了进一步分析小结构域对识别活性的影响,通过对小结构域的蛋白结构分析发现在其结构域中存在关键的、多变的Loop（357~367aa）结构,因此我们将裂殖酵母和四膜虫eRF1小结构域中的Loop结构引入到杂合的Tt/Sc eRF1中。

分析结果显示,引入两种不同Loop结构到Tt/Sc eRF1嵌合体中,均可识别三个终止密码子,说明Loop结构显著的影响终止密码子的识别活性。由此表明,四膜虫eRF1的N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,也说明eRF1的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。

参考文献

[1]PABP enhances release factor recruitment and stop codon recognition during translation termination[J].Alexandr Ivanov,Tatyana Mikhailova,Boris Eliseev,Lahari Yeramala,Elizaveta Sokolova,Denis Susorov,Alexey Shuvalov,Christiane Schaffitzel,Elena Alkalaeva.Nucleic Acids Research.2016(16)

[2]Structure of a human translation termination complex[J].Matheisl Sarah,Berninghausen Otto,Becker Thomas,Beckmann Roland.Nucleic Acids Research.2015(18)

[3]Cryoelectron Microscopic Structures of Eukaryotic Translation Termination Complexes Containing eRF1-eRF3 or eRF1-ABCE1[J].Anne Preis,Andre Heuer,Clara Barrio-Garcia,Andreas Hauser,Daniel E.Eyler,Otto Berninghausen,Rachel Green,Thomas Becker,Roland Beckmann.Cell Reports.2014(1)

[4]Selectivity of stop codon recognition in translation termination is modulated by multiple conformations of GTS loop in eRF1[J].Leo E.Wong,Yan Li,Shubhadra Pillay,Ludmila Frolova,Konstantin Pervushin.Nucleic Acids Research.2012(12)

[5]闫静.eRF1的C端结构域在终止密码子识别过程中的功能[D].山西大学,2017.