人谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人谷胱甘肽（GSH）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人谷胱甘肽（GSH）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于可食植物种子中还原型谷胱甘肽（GSH）和蛋白巯基（P-SH）含量的测定研究

选用的衍生化试剂是DTNB（5,5’-二硫双-2-硝基苯甲酸）,因其对巯基具有选择性,可以与其发生定量衍生化反应。用含过量DTNB的提取液,利用细胞破壁和衍生化同时进行的前处理方式,分别用HPLC法、光谱法实时检测了可食植物种子中GSH与蛋白巯基（P-SH）含量,并从中筛选出了五种富含GSH和蛋白巯基的可食植物种子。

通过高效液相色谱法测定结果发现,金花葵、西州蜜、黄蛋子、伊丽莎白瓜、苦瓜中含较丰富的GSH和蛋白巯基（P-SH）,其中金花葵籽中GSH和P-SH的巯基含量测定结果分别为1.1057μmol/g（GSH）和2.9835μmol/g（P-SH）,西州蜜籽中GSH和P-SH的巯基含量测定结果分别为0.6441μmol/g和5.3751μmol/g,黄蛋子籽中GSH和P-SH的巯基含量测定结果分别为0.7551μmol/g和4.2532μmol/g,伊丽莎白瓜籽中GSH和P-SH的巯基含量测定结果分别为1.0318μmol/g和5.1724μmol/g。

苦瓜籽中虽然没有检测到GSH等小分子巯基化合物,但含相对丰富的蛋白巯基（P-SH）,测定结果为4.0596μmol/g。本研究中高效液相色谱法（HPLC）测定方法的回收率在99.46%-101.28%之间,GSH和P-SH测定检测限分别为0.0937μmol/g和0.1394μmol/g,基本满足准确测定的要求。其中,还对各样品进行了对应的荧光光谱法和紫外光谱法的测定,发现荧光光谱法测定（GSH）的含量和紫外光谱法测定总巯基（-SH）含量的结果基本和色谱测定结果相吻合。

但是,其中金花葵籽色谱测定总巯基含量与紫外-可见分光光度法测定的结果相差较大,经查阅文献可知,金花葵籽中含有大量的黄酮类物质,故对其进行了干扰实验。通过干扰实验的结果可知,在光谱法测定中大量的黄酮类可能会对结果产生一定影响,导致总疏基的含量测定结果偏高,但是在色谱中加入的干扰物质并没有影响谷胱甘肽以及总巯基含量的测定结果。

参考文献

[1]Characteristics of antioxidant activity and composition of pumpkin seed oils in 12 cultivars[J].Agnieszka Nawirska-Olszańska,Agnieszka Kita,Anita Biesiada,Anna Sokó?-??towska,Alicja Z.Kucharska.Food Chemistry.2013(1-4)

[2]Glutathione transporters[J].Anand K.Bachhawat,Anil Thakur,Jaspreet Kaur,M.Zulkifli.BBA-General Subjects.2012

[3]Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes[J].Marcel Deponte.BBA-General Subjects.2012

[4]Antioxidant metabolism of grapefruit infected with Xanthomonas axonopodis pv.citri[J].Naveen Kumar,Robert C.Ebel,Pamela D.Roberts.Environmental and Experimental Botany.2010(1)

[5]应译娴.可食植物种子中还原型谷胱甘肽（GSH）和蛋白巯基（P-SH）含量的测定[D].延边大学,2018.