革兰氏染色液试剂盒的应用

背景^[1-3]

革兰氏染色液试剂盒可用于细菌的革兰氏染色试验。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌细胞壁较厚，肽聚糖网层次较多且交联致密，乙醇脱色时，肽聚糖脱水使孔径缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。革兰氏阴性菌细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，脱色后类脂外膜迅速溶解，缝隙加大，结晶紫与碘复合物溶出，因此乙醇脱色后再经番红复染，呈红色。

检验原理：

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此，能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色液试剂盒

操作步骤：

1.涂片固定：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2.染色：一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

(1)加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。

(2)加上碘液后染色1分钟，水洗。

(3)加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20-60秒，水洗，吸去水分。

(4)加上番红后，染色1分钟，水洗。

(5)吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解，都常呈阴性反应。

3. 结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈现假阳性。

应用^[4][5]

用于两株革兰氏染色性质不同的细菌促进碳酸盐矿物形成的对比研究

利用Bacillus cereus LV-1菌株（G+）和Curvibacersp.HJ-1菌株（G-）在相同培养基中分别进行为期30d的培养实验,同时利用胞外聚合物进行了120 h的气体扩散实验,测定了溶液的pH值、电导率、离子浓度、胞外多糖含量、碳酸酐酶活性、矿物种类和形态及其碳同位素组成等。

研究结果可以概括为以下几点:（1）LV-1菌株和HJ-1菌株均具有在不含CO32-的培养基中诱导碳酸盐矿物形成的能力。前者在第30 d时形成的矿物总质量为26.5 mg,晶体尺寸约为40μm;后者在第30d时形成的矿物总重量为14mg,晶体尺寸约为6μm。

（2）在Mg/Ca=1的培养基中两株细菌均诱导形成方解石;在Mg/Ca=5的培养基中主要诱导形成碳钙镁石。

（3）LV-1菌株和HJ-1菌株诱导形成的矿物在形态上存在较大差异。前者形成的方解石主要呈不规则状和立方体状;碳钙镁石呈柱状、块状和球状。后者形成的方解石主要呈短杆状、哑铃状、球状;碳钙镁石呈六面体状、不规则状和长板状。

（4）革兰氏染色性质不同的细菌均诱导形成方解石,不同的是,革兰氏阴性菌HJ-1菌株更易作为矿物的成核模板,导致哑铃状矿物的形成。革兰氏阳性菌LV-1菌株更易导致不规则状矿物的形成。

（5）微生物代谢影响矿物中碳同位素组成。细菌介导的方解石δ13C=-17.410‰与胰蛋白胨的δ13C=-14.704‰比较接近,这说明碳酸盐矿物沉淀的碳主要来源于胰蛋白胨。

（6）胞外聚合物对碳酸盐矿物种类和形态的影响。LV-1菌株分泌的胞外聚合物有利于高镁方解石的形成,且大多数呈花菜状;HJ-1菌株分泌的胞外聚合物有利于文石的形成,文石呈棱柱状、半球状。

（7）培养液中的pH值与矿物质量呈显著正相关关系,Ca2+浓度与矿物质量呈显著负相关关系,说明较高的pH值即溶液的碱性环境有利于碳酸盐矿物的形成,且Ca2+浓度的下降可间接地指示矿物的生成。

参考文献

[1]Augmenting Microbially Induced Carbonate Precipitation of Soil with the Capability to Self-Heal[J].Stefani Botusharova,Diane Gardner,Michael Harbottle.Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering.2020(4)

[2]Biomineralization of Carbonate Minerals Induced by The Moderate Halophile Staphylococcus Warneri YXY2[J].Yu Han,Bin Sun,Huaxiao Yan,Maurice E.Tucker,Yanhong Zhao,Jingxuan Zhou,Yifan Zhao,Hui Zhao.Crystals.2020(2)

[3]Spectrophotometric determination of pH and carbonate ion concentrations in seawater:Choices,constraints and consequences[J].Jian Ma,Huilin Shu,Bo Yang,Robert H.Byrne,Dongxing Yuan.Analytica Chimica Acta.2019(C)

[4]Characterization of the extracellular polymeric substances（EPS）of Virgibacillus strains capable of mediating the formation of high Mg-calcite and protodolomite[J].Zulfa Ali Al Disi,Nabil Zouari,Maria Dittrich,Samir Jaoua,Hamad Al Saad Al-Kuwari,Tomaso R.R.Bontognali.Marine Chemistry.2019(C)

[5]孙君.两株革兰氏染色性质不同的细菌促进碳酸盐矿物形成的对比研究[D].南京农业大学,2020.