人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)ELISA试剂盒可用于定量测定人血清和血浆中的HMGB1含量。此外，该试剂盒可用于来自牛，猪，兔，小鼠和大鼠的血清，血浆和脑脊液（CSF）的研究。也可以检测细胞培养基和BALF（支气管肺泡液）。

HMGB1是大约30kDa的蛋白质，是非组蛋白核蛋白组的主要成分。HMGB1（高迁移族Box1蛋白）是转录调节因子，通常存在于哺乳动物细胞的细胞核和细胞质中。

HMGB1在恶性疾病等疾病的发病机理中起重要作用。在肿瘤的情况下，细胞的氧供应可以断开。这导致细胞死亡（坏死）和释放HMGB1，进而导致在相邻肿瘤环境中形成朝向肿瘤的血管生成。这些血管确保肿瘤的存活和进一步的生长。

体外研究表明，通过定量测定HMGB1浓度，可以区分病理性细胞死亡（坏死）和生理细胞死亡（细胞凋亡）。在坏死中观察到更高的HMGB1值。

HMGB1在脓毒性休克后期也起重要作用。结果表明，即使在脓毒性休克后期，HMGB1在动物实验中的抑制显着提高了啮齿动物的存活率。

HMGB1通过与RAGE（“晚期糖基化终产物的受体”）结合起作用，具有与细胞因子TNF-α和IL-6相似的促炎作用。脓毒症患者血清中也可见高值。

血液中的HMGB1浓度在许多其他疾病中也增加，包括类风湿性关节炎（RA）急性肺损伤（ALI）和弥散性血管内凝血（DIC）。

人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)ELISA试剂盒

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在过敏性紫癜患儿血清中的表达及临床意义研究

检测过敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura,HSP）患儿外周血高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因表达水平,分析其与实验室指标相关性,初步探讨HMGB1在HSP发病中的作用,为今后HSP的临床治疗提供理论依据。

方法:采用Real-time PCR法检测过敏性紫癜患儿21例（HSP组）、紫癜性肾炎患儿16例（HSPN组）及对照组儿童22例外周血HMGB1 m RNA相对表达量,检测HSP组及HSPN组患儿血清白细胞计数（WBC）、中性粒细胞百分比（NE）、C反应蛋白（CRP）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、血小板（PLT）、D-二聚体、免疫球蛋白A（Ig A）等实验室指标。结果:（1）HSPN组、HSP组及对照组儿童外周血HMGB1m RNA相对表达量分别为15.88（11.5461.34）、9.65（3.8026.72）、1.01（1.001.06）,HSPN组HMGB1 m RNA表达量高于HSP组及对照组,HSP组其表达量高于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）;

（2）HSP组各分型中混合型、腹型、单纯型其外周血HMGB1 m RNA表达量分别为18.14（10.5428.97）、12.19（4.9332.60）、2.93（0.885.69）,其中混合型及腹型HSP患儿表达量高于单纯型HSP患儿,差异有统计学意义（P<0.05）,混合型患儿表达量高于腹型患儿,但差异无统计学意义（P>0.05）;

（3）HSP组及HSPN组患儿外周血HMGB1 m RNA表达量与WBC（r=0.89）、NE（r=0.93）、CRP（r=0.73）、IL-6（r=0.82）、TNF-a（r=0.94）、PLT（r=0.78）、D-二聚体（r=0.59）、Ig A（r=0.64）等指标呈正相关,均P<0.05。

结论:HSPN组与HSP组外周血HMGB1 m RNA表达量明显高于对照组,表明HMGB1可能参与了HSP发病且与肾损害有关;HSP组患儿各分型中混合型与腹型患儿HMGB1 m RNA表达量明显高于单纯型患儿,推测HMGB1可作为HSP疾病严重程度评估指标;试验组外周血HMGB1与血清WBC、NE、CRP、IL-6、TNF-a、PLT、D-二聚体等呈正相关,推测HMGB1参与疾病炎症及高凝状态。

参考文献

[1]The Role of Endothelial Dysfunction and Inflammation in Chronic Venous Disease[J].R.Castro-Ferreira,R.Cardoso,A.Leite-Moreira,A.Mansilha.Journal of Vascular Surgery:Venous and Lymphatic.2018(4)

[2]Inflammation and thrombosis:roles of neutrophils,platelets and endothelial cells and their interactions in thrombus formation during sepsis.[J].Iba T,Levy J H.Journal of thrombosis and haemostasis:JTH.2018(2)

[3]Enzymatic sialylation of IgA1 O-glycans:implications for studies of IgA nephropathy.[J].Kazuo Takahashi,Milan Raska,Milada Stuchlova Horynova,Stacy D Hall,Knud Poulsen,Mogens Kilian,Yoshiyuki Hiki,Yukio Yuzawa,Zina Moldoveanu,Bruce A Julian,Matthew B Renfrow,Jan Novak.PLoS ONE.2017(2)

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[5]米热阿依·买买提依明.高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在过敏性紫癜患儿血清中的表达及临床意义[D].新疆医科大学,2021.