热带念珠菌的检测及感染者的治疗方法

背景及概述^[1][2]

热带念珠菌(Candida tropicalis)为条件致病菌，在自然界广泛存在，也可寄居在人体皮肤、阴道、口腔、消化道等部位。当人体抵抗力下降或皮肤局部环境发生变化时，热带念珠菌即可大量繁殖，引起相应部位的感染乃至系统性感染。其致病因子包括其生物膜、菌丝等，因而其感染率高。

检测^[1]

目前，多使用显色法从众多种念珠菌中区分热带念珠菌，但是，显色法耗时长，其中，某些显色法中，热带念珠菌的检测易与光滑念珠菌混淆，不能准确地对热带念珠菌进行快速的检测。因此，建立快速、有效的检测热带念珠菌的方法尤为重要。

环介导恒温扩增技术(Loop‐mediated isothermal amplification，LAMP) 是日本学者Notomi等提出一种全新的核酸扩增技术，该技术具有特异性强、灵 敏度高、检测成本低和操作步骤简便等优点。近年来，越来越多的研究人员将该方法运用于细菌、病毒等微生物的检测或对该方法进行改进。而实时荧光检测技术采用完全闭管操作，排除了其他干扰因素，因而具有高灵敏性的优点。

目前，已有关于将两种技术相结合的新技术——实时荧光环介导恒温扩增 (Real-Time fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification，ReaLamp)检测方法的相关研究，但在国内尚未有将此新技术应用于热带念珠菌的检测方面的发明。CN201610407728.5运用上述技术建立了热带念珠菌的ReaLamp检测试剂盒、引物和方法，并从其特异性、灵敏度、重复性等方面对该方法进行评价。

CN201610407728.5还提供一种检测热带念珠菌的引物。技术方案如下：一种检测热带念珠菌的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQID NO.1 和SEQID NO.2的内引物，序列组成为SEQID NO.3和SEQID NO.4的外引物，序列组成为SEQID NO.5的环引物。

CN201610407728.5还提供一种检测热带念珠菌的方法。技术方案如下：采用实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的试剂盒，包括以下步骤：

1)提取待检测样品的基因组；

2)加待检测样品、所述内引物、外引物、和环引物，以及加荧光染料Ⅰ后构成反应体系，进行环介导恒温扩增；

3)检测扩增产物。

本方法具有以下优点：本发明针对热带念珠菌5.8S和26S rRNA基因之间的ITS2区序列设计筛选得到特异性的LAMP引物，对热带念珠菌的靶标基因具有很好的扩增效率。对非热带念珠菌进行ReaLamp的扩增，均未出现非特异性的扩增，说明该引物对热带念珠菌有较好的扩增能力。而且，本发明所述的实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的试剂盒灵敏度高，扩增引物对纯培养物中的热带念珠菌的灵敏度可达到1.28pg/ul。进行重复性试验，结果显示具有很好的重复性。本发明所述的实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的 试剂盒即检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好，操作简单、快捷、便于批量检测等特点，为热带念珠菌的检测提供了新的发展方向。

治疗方法^[2]

CN201680020951.2提供抗CaENO1抗体(CaS1)及人类化抗体，其作为抗由念珠菌(优选为念珠菌属、更佳地白色念珠菌、热带念珠菌)、耐氟康唑念珠菌(优选为耐氟康唑念珠菌属)、链球菌或葡萄球菌引起的感染的有效诊断剂或治疗性治疗。在本发明中，重组CaENO1及CaS1 scFv经成功地表达且纯化。CaS1 scFv识别白色念珠菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌的ENO1蛋白质；尤其CaS1 scFv自临床结合至耐氟康唑白色念珠菌及热带念珠菌，且对小鼠及人类的彼等耐氟康唑白色念珠菌及热带念珠菌具有较弱交叉反应性。

本发明亦提供一种抗原决定基序列，其由位于CaENO1中的以下组成的氨基酸序列：283LYEQLISEYP292(SEQ ID NO:1)、278PQLADLYEQL287(SEQ ID NO:2)、240KGKVGIAMDV249 (SEQ ID NO:3)或278PQLADLYEQLISEYP292(SEQ ID NO:4)。本发明亦发现多株IgY抗体对由白色念珠菌表达的重组CaENO1蛋白质以及原生 CaENO1展示结合活性，表明在鸡中引发较强体液性反应。用短或长连接符建构的抗体库的复杂性分别为2.4×106及1.36×107。在严格筛选之后，显性CaS1 scFv特定地识别白色念珠菌及热带念珠菌的ENO1蛋白质。

另外，CaS1 scFv自临床结合至耐氟康唑白色念珠菌及热带念珠菌。CaS1亦减弱白色念珠菌的生长且抑制其附着至口腔表皮样癌细胞(OECM-1)。另外， CaS1显著抑制白色念珠菌的表面ENO1结合至纤维蛋白溶酶原，如通过纤维蛋白基质-凝胶 降解分析所展示。显著地，活体内动物测试展示CaS1抗体延长患有念珠菌血症的小鼠的存活时间。因此，本发明识别对CaENO1具有特定结合活性的新颖CaS1 scFv单株抗体。所有结果将共同在抗白色念珠菌和热带念珠菌的感染的治疗性抗体药物用于临床应用上提供巨大帮助。

主要参考资料

[1] CN201610407728.5 检测热带念珠菌的试剂盒、引物和方法

[2]CN201680020951.2 抗感染疾病的抗体