南瓜籽蛋白

高血压是最常见的慢性心血管疾病，与人类多种脏器并发症紧密联系，严重危害人类的健康。目前，临床降血压药物血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂如卡托普利、阿拉普利、依那普利和赖诺普利等虽然药效明显，但会引起呕吐、心悸等副作用。近年来，食物源生物活性肽因其营养、安全性引起了极大的关注。

南瓜籽中含有30%～40%的蛋白质，氨基酸组成丰富，是一种较好的植物蛋白资源。目前，关于南瓜籽蛋白源ACE抑制肽的研究相对较少，南瓜籽肽可能存在的ACE抑制分子机制也不够清楚。因此，江苏经贸职业技术学院健康学院的何海艳、杨爱萍等人采用碱性蛋白酶水解南瓜籽蛋白释放ACE抑制肽，通过膜分离技术获得ACE抑制肽并通过质谱技术鉴定其结构，同时利用ACE抑制活性实验、自发性高血压大鼠（SHRs）模型、抑制动力学和分子对接方法研究ACE抑制肽的降血压活性和酶抑制机制，以期为南瓜籽降血压肽的开发提供理论依据。

1、南瓜籽蛋白的水解及水解物膜分离组分的活性分析

如图1A所示，南瓜籽蛋白的水解度与水解时间呈正相关，水解开始1 h内水解度增加较快，水解度达到7.99%；60～200 min内水解度增加了2.99%，水解反应速率明显变慢，4 h后水解度达到11.23%，南瓜籽蛋白在碱性蛋白酶的作用下充分释放了其中的活性肽。

由图1B可知，1 mg/mL质量浓度下，PPH ACE抑制活性也因水解物分子质量的不同而有所差别。PPH和低于1 kDa肽组分的ACE抑制活性较高，二者ACE抑制活性没有显著性差异（P＞0.05），分别为46.81%和46.22%；除3～5 kDa组分外，ACE抑制活性随着PPH分子质量的增大而逐渐降低，5～10 kDa组分ACE抑制活性最低，抑制率为33.74%。

PPH的降血压活性如图1C所示，SHRs灌胃PPH（100 mg/kg mb）后，PPH及低于1 kDa PPH组分在灌胃4 h时表现出了相似的降血压效果，均降低SHRs收缩压约14.80 mm Hg，而低于1 kDa PPH组分在灌胃6 h时表现出了的降血压效果，降低SHRs的收缩压约21.42 mm Hg，低于1 kDa PPH组分的降血压活性优于PPH；低于1 kDa PPH组分虽然表现出持续的降血压效果，但是仍差于降血压药物卡托普利。

2、南瓜籽蛋白肽结构鉴定

为了确定可能引起活性的肽段结构，采用HPLC/Q-TOF-MS/MS鉴定了低于1 kDa PPH组分中南瓜籽蛋白肽组成。在获得低于1 kDa PPH组分的总离子流色谱图和一级质谱图（图2）的基础上，利用PEAKS Studio软件分析并比对UniProt数据库，从低于1 kDa PPH组分中鉴定出了9 种多肽，分别是Leu-Leu-Val（LLV）、Leu-Val-Phe（LVF）、Leu-Thr-Pro-Leu（LTPL）、Ser-Val-Leu-Phe（SVLF）、Leu-Leu-Pro-Gln（LLPQ）、Met-Leu-Pro-Leu（MLPL）、Leu-Leu-Pro-Gly-Phe（LLPGF）、Val-Leu-Leu-Pro-Glu（VLLPE）、Arg-Phe-Pro-Leu-Leu（RFPLL）。此外，通过尝试检索生物活性肽数据库发现所鉴定的9 种南瓜籽肽均未出现在这些ACE抑制肽或者降血压肽数据中，仅发现了类似的降血压肽序列，如LLY、LVY、LVE、LLP、LLF等（检索数据库：http://bis.zju.edu.cn/biopepdbr/index.php、http://pepbank.mgh.harvard.edu、http://www.nipgr.ac.in/PlantPepDB/），说明本研究从PPH发现了新的ACE抑制肽。

3、南瓜籽肽的ACE抑制活性及降血压活性

如图3A所示，9 种多肽RFPLL、VLLPE、LLPGF、MLPL、LLPQ、SVLF、LTPL、LVF、LLV的ACE半抑制浓度（IC50）分别为0.94、16.57、0.48、0.36、5.32、7.11、5.07、0.17、3.16 mmol/L，其中LLPGF、MLPL、LVF和RFPLL的IC50均低于1 mmol/L，具有较高的ACE抑制活性。

进一步评价了ACE抑制活性较好的南瓜籽肽LLPGF、MLPL、LVF和RFPLL的降血压活性（图3B、C）。总体看来，RFPLL具有较好的降血压活性，灌胃SHRs 6 h后使其收缩压降低37.0 mm Hg、舒张压降低17.0 mm Hg；其次是LVF，灌胃SHRs 6 h后使其收缩压降低22.2 mm Hg、舒张压降低11.2 mm Hg；而LLPGF和MLPL的降血压活性相对较差；RFPLL和LVF灌胃SHRs 24 h后仍然具有一定的降血压活性，并且在测试的剂量下RFPLL与卡托普利降血压效果较为接近，说明从南瓜籽蛋白中获得了效果较好的降血压肽。

4、南瓜籽肽抑制ACE的动力学分析

由图4可知，RFPLL是ACE混合型抑制剂，低浓度下（0.5 mmol/L）RFPLL对ACE是竞争性抑制，较高浓度（1 mmol/L）表现出了非竞争抑制作用；MLPL的双倒数直线近似相交于y轴，说明其对ACE的抑制模式可能是竞争性抑制，而LLPGF、LVF可能是非竞争性抑制类型。

5、南瓜籽肽与ACE的分子对接

结果可知，RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF均能够较好地对接于ACE的活性中心残基，其中，RFPLL与ACE的残基Tyr523、Glu162、Asp377之间形成3个氢键，并通过O31、O28螯合Zn2+，获得了较低的静电势能－231.64 kJ/mol，说明RFPLL能够通过结合ACE活性位点S1、S1’及三联体催化部位发挥抑制活性；小分子肽LVF与ACE的5个残基His353、Ala354、Tyr520、Lys511、Gln281之间形成9个氢键，并且O2与Zn2+的距离仅有2.78 Å。

结论

结果表明：

1）低于1 kDa PPH组分具有较高降血压活性，灌胃6 h后可以降低SHRs的收缩压约21.42 mm Hg；2）南瓜籽肽RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF具有较好的ACE抑制活性，IC50均低于1 mmol/L，其中RFPLL和LVF具有较好的降血压活性，灌胃6 h后分别使SHRs的收缩压降低37.0 mm Hg和22.2 mm Hg、使SHRs的舒张压降低约17.0 mm Hg和11.2 mm Hg；3）RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF可以很好地对接ACE的活性中心，RFPLL是ACE混合型抑制剂，MLPL对ACE是抑制模式可能是竞争性抑制，LLPGF、LVF可能是ACE的非竞争性抑制剂。综上，低于1 kDa PPH是一种良好的降血压功能食品原料，而RFPLL和LVF可用于降血压功能食品或者药品的开发原料。

本文《南瓜籽蛋白源血管紧张素转化酶抑制肽的制备及其降血压活性》来源于《食品科学》2021年42卷23期214-220页，作者：何海艳，刘梦婷，杨爱萍，蒋彩云，崔逸，汪洪涛。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201118-197。