己糖激酶的制备

发布日期:2022/3/25 9:25:19

背景及概述

己糖激酶(Hexokinase)是生物体呼吸代谢过程中的关键酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用。己糖激酶存在于所有细胞中，是细胞产生能量所需要的一种酶，共有 5 种亚型，其中 I 和 II 分布在线粒体外膜，与电压依赖性阳离子通道蛋白结合;这种部位让己糖激酶能直接获得线粒体产生的 ATP，ATP是己糖激酶的底物之一。研究证明，己糖激酶在固有免疫系统中发挥模式识别受体功能，类似免疫系统的守门人角色，具有重要的功能。这种机制不仅在动物细胞存在，在人体细胞内同样存在。因此，己糖激酶常被用作监测人体健康状况的指标，目前己糖激酶已应用于血糖检测试剂盒中，利用己糖激酶法测定血糖含量是国际上推荐的葡萄糖测定方法，但因己糖激酶是小酶种，中国研究领域对其关注度不高，市场上的己糖激酶制剂均为进口产品，故血糖检测试剂盒价格相对较高。现提供了一种制备己糖激酶干粉的方法，并对所制得的干粉进行了酶学性质研究，为降低己糖激酶血糖检测试剂盒的成本提供了理论依据。

制备

菌种的制备[1]：将冻存管的菌种BW25113-pYBE／sc己糖激酶活化后，以1％接种量接种于含有50μg／mL琏霉素的基础培养基中，于37℃，180 r／min的条件下培养8 h。

基础发酵工：将上述培养的种子液以2％接种量转接到100 mL／500mL的基础培养基中，于37℃、180 r／min的条件下培养至1．5 h后加入1 mL 20％的L-阿拉伯糖诱导，之后在相同条件下培养14 h。

菌体的破壁工艺：将上述培养的发酵液在4℃，10 000 r／min条件下离心10 rain收集菌体细胞，并用50 mmol／L、pH 7．6的TEA-HCL缓冲液溶解于50 mL离心管，在冰浴条件下，选用6 mm变幅杆、200 W的功率进行细胞破碎，破壁期间超声波工作1．5 S间歇1s，设1，2，3，4，5，6，7，8min 8个破壁总时长，破壁后分别对破壁菌体进行显微观察，以破碎菌体数对菌体总数的比值来计算破壁率，并对离心后收集的上清液进行酶活性测定，综合破壁率和酶活力指标确定破壁时长。

己糖激酶的纯化工艺：重组己糖激酶采用镍柱亲和层析法进行纯化。将获得的己糖激酶上清液利用pH 8．0含50 mmol／L NaH2PO。、2mmol／L咪唑、0．3 mol／L NaCl的洗涤液对杂蛋白进行洗脱，之后利用pH 8．0含50 mmol／L的NaH2PO4、50 mmol／L咪唑、0．3 mol／L的NaCl的洗脱液对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱液后用SDS-PAGE进行分析。

酶活性测定方法：将收集的己糖激酶粗酶液活力进行测定。分别添加1 mL浓度为0．05mol／L的TEA-HCL，1 mL浓度为0．555 mol／L的肛葡萄糖，0．1 mL浓度为0．019 mol／L的ATP，0．2mL浓度为0．1 mol／L的MgCl2，0．2 mL浓度为0．014 mol／L的NADP+，0．02 mL浓度为125U／mL的葡萄糖一6一磷酸脱氢酶到试验管和空白管，混匀后于25℃水浴1 min，于340 nm处读取吸光值A1。然后试验管加入0．05 mL待测酶液，空白管加入0．05 mL的ddH20，于25℃继续反应5 min，后读取吸光值A2。酶活力计算公式如下图：（式中，2．57为反应液总体积，Df为稀释倍数，6．22为p-NADPH在340nm处的吸光系数，0．05为比色皿体积。）

图1 酶活力计算公式

冻干工艺：通过对制得的己糖激酶干粉进行研究，初步确定己糖激酶酶学性质。己糖激酶的最适温度为 50 ℃，热稳定性试验表明己糖激酶具有一定的耐热性。此外，己糖激酶最适 pH 在 8. 0 左右，说明该己糖激酶较适于中性偏碱的条件，在 pH7. 0 ～9. 0 之间比较稳定，处理 20 h后仍有较高的活性，为己糖激酶应用于血糖检测试剂盒奠定了基础。

结果与讨论

超声波破壁提取己糖激酶粗酶液常见的微生物菌体破壁提取胞内酶的方法有超声破碎、酶溶法、高压匀浆法等。通过对比溶菌酶、溶壁酶、超声破碎提取菌株BW25113-pYBE／sc己糖激酶发酵生产的己糖激酶发现，酶溶法可以破碎大肠杆菌细胞壁，但最终检测酶活性指标异常偏低，推测溶菌酶与溶壁酶可能会影响己糖激酶的活性。本研究采取超声波破壁方法提取胞内酶己糖激酶，超声破壁对胞内酶的提取影响比较复杂，超声时间短菌体破壁不充分，胞内酶不能充分释放；超声时间过长则会对酶的构象产生影响，进而改变酶的活性。本试验超声波破壁结果所示，5～8分钟的破壁率均能达到100％，菌体破壁充分，但5分钟以上的破壁总时长会降低酶活性，故最终选择破壁总时间为5分钟。

超声波破壁后得到粗酶液，用镍柱亲和层析法进行纯化，其中CL为破壁后的粗酶液条带，经过纯化工艺后获得单一的蛋白条带(E3)，分子量大小为60 kD，经测定表现为己糖激酶活性，粗酶液经纯化后获得纯度较高的己糖激酶。