人二胺氧化酶(DAO)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人二胺氧化酶(DAO)ELISA KIT运用竞争法ELISA法定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中二胺氧化酶(DAO)含量。

标本的采集及保存

1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

人二胺氧化酶(DAO)ELISA KIT

操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

用于血清二胺氧化酶（DAO）速率法试剂盒制备及临床应用研究

二胺氧化酶（diamine oxidase;DAO,E.C.1.4.3.6）是人和哺乳动物中小肠粘膜上层绒毛和胎盘绒毛中具有高度活性的催化二胺（组胺、腐胺和尸胺）氧化的酶（细胞内酶）。DAO在分裂细胞中高度表达。在肠粘膜细胞坏死脱落入肠腔,使肠粘膜DAO活性降低,肠内容物DAO活性升高;DAO进入肠细胞间隙,使血浆中DAO活性升高,血浆DAO活性的变化,可在无创情况下反映肠道损伤和修复情况,因此,它将作为探讨肠道功能损伤的年重要指标。胎盘中含有较高的二胺氧化酶（DAO）活性。孕妇血清中表现出DAO活性增高。妊娠妇女血清DAO活性测定,对妊娠期的监测具有重要意义,尤其是有先兆流产史的患者,测定DAO活性已成为新的重要指标。

利用两种不同的试剂组成,在不同的时间内进行偶联反应,成功的制备了血清DSO速率法试剂盒。可灵敏、准确、快速地对人血清中的DAO活性进行测定。本实验制备的血清DSO速率法试剂盒,经特异性、灵敏度、精密度、线性和稳定性的相关比较检定,结果符合临床检测的要求。

经临床初步检测证明人血清DSO速率法试剂盒可灵敏、准确地对人血清的DSO活性进行测定。血清DAO活性测定有可能成为肠道损伤、严重创伤后由肠道屏障功能损伤、多器官功能紊乱综合征（MODS）、妊娠期的胎盘监测具有重要意义的生物化学指标。为血清DAO进一步的临床应用奠定了基础。

参考文献

[1]Screening of Novel Matrix Metalloproteinases（MMPs）in Human Fetal Membranes[J].Stephen J.Fortunato,Ramkumar Menon.Journal of Assisted Reproduction and Genetics.2002(10)

[2]Human intestinal diamine oxidase（DAO）activity in Crohn’s disease:A new marker for disease assessment?[J].Agents and Actions.1990(1)

[3]The human fatty acid-binding protein family:Evolutionary divergences and functions[J].Smathers Rebecca L,Petersen Dennis R.Human Genomics.2011(3)

[4]Management of Postoperative Ileus[J].David Stewart,Kenneth Waxman.Disease-a-Month.2010(4)

[5]董理.血清二胺氧化酶（DAO）速率法试剂盒制备及临床应用研究[D].吉林大学,2006.