人正常肝细胞的应用

背景^[1-3]

人正常肝细胞是一株正常肝细胞系，具有典型的肝细胞形态学特征，可用于多种实验研究。

肝细胞呈多面体形；核大而圆,居中,常染色质丰富,部分有双核或多倍体核；胞质嗜酸性,含弥散分布的嗜碱性团块EM（电镜）：（1）有三种功能面→血窦面→胆小管面→细胞连接面：有紧密连接、桥粒、缝隙连接(2)细胞器发达粗面内质网:合成白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原、脂蛋白和补体等血浆蛋白；滑面内质网：参与生物转化和代谢，如胆汁合成、脂类代谢、糖代谢、激素代谢和有机异物的转化；高尔基复合体：参与蛋白的加工和胆汁排泌线粒体、溶酶体和过氧化物酶体丰富(3)含糖原、脂滴、色素等内涵物肝细胞核肝细胞核主要由去氧核糖核酸(DNA)和组蛋白等组成。

人正常肝细胞

去氧核糖核酸是遗传的物质基础，它有复制遗传信息的功能。患肝炎时，肝炎病毒侵入肝细胞核内，病毒基因可能与肝细胞核中去氧核糖核酸相结合(整合)。一旦整合，HBsAg即难以清除，致使HBsAg长期携带。此外，去氧核糖核酸还可能以自己为模板合成信使核糖核酸(mRNA)，从而控制细胞质中各种相应蛋白质的合成。肝细胞核如果明显受损，就意味着整个肝细胞崩解毁灭。

线粒体肝细胞的线粒体很多，每个细胞大约有1000个左右，遍布于胞质内。肝小叶不同部位肝细胞内线粒体的大小和形态不完全一致，在正常生理条件下，多为圆形和卵圆形，直径0.4-0.8μm。线粒体的共同基本形态结构特征是外被双层界膜--外界膜和内界膜，内界膜向线粒体内部伸展转折，形成许多嵴。内界膜将线粒体分隔为内、外两室，外室介于内、外界膜之间，内室则围于内界膜之间，其中充满基质。

处理方法：

1.37°C水浴预热培养基；

2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；

3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；

4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；

5.置于37°C，5%CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)；

6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。

应用^[4][5]

用于基于脂质组学研究反式脂肪酸对人正常肝细胞脂质代谢的影响研究

以人正常肝细胞LO2细胞为实验对象,选择9t16:1和11t18:1代表R-TFA,9t18:1代表I-TFA,此外,依据健康人血液（HHB）、心血管疾病人血液（CHB）、牛奶（CM）以及氢化大豆油（HSO）中TFA的比例分别配置了4种反式脂肪酸混合物（TFA-mixture）,将它们作用于LO2细胞,观察TFA对LO2细胞功能的影响;基于脂质组学技术,考察TFA对LO2细胞脂质轮廓的影响,通过偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和t-检验（student’s t test）找出差异代谢物从而找到差异代谢通路,并对其进行验证,揭示不同来源TFA对LO2细胞脂质代谢的影响并阐明机理。

结果如下:1、通过测定细胞存活率、细胞膜完整性、细胞内活性氧（ROS）相对含量、细胞内甘油三酯（TAG）含量以及细胞内总胆固醇（TC）含量变化,发现TFA和TFA-mixture对LO2细胞都有一定的损伤作用,都会降低细胞的活力和细胞膜的完整性,提高细胞内ROS水平,造成细胞内TAG和TC的增加。并且,代表I-TFA的9t18:1对LO2细胞功能的损伤作用要明显高于代表R-TFA的9t16:1和11t18:1（p<0.05）;而CHB和HSO对肝细胞损伤作用也显著性强于HHB和CM（p<0.05）。通过对细胞内脂肪酸组成和含量的测定发现,LO2细胞对9t18:1、9t16:1和11t18:1的吸收率各不相同,其中对9t18:1的吸收率是最高的。此外,11t18:1在LO2细胞中会发生β氧化反应和△9去饱和反应,分别转化为9t16:1和9c11t-CLA;9t16:1也会在LO2细胞中发生△9去饱和反应,先转化为11t18:1,然后进一步转化为9c11t-CLA;而9t18:1不发生这些反应。所以推测,不同来源的TFA之间功能有差异可能是由于它们在细胞中有不同的吸收率和不同的生物转化作用。

2、基于脂质组学分析结果,发现不同来源的TFA及其混合物在100μM的浓度下作用于LO2细胞24h后,细胞内各种脂质的含量发生显著变化,其中,TAG、磷脂（PL）和氧化脂质（OL）含量显著升高。多元统计学分析结果表明9t18:1组和11t18:1组之间贡献的差异代谢物是TAG（16:0/18:2/18:3）、TAG（16:1/18:1/16:2）和PI（16:2/18:2）;9t18:1组和9t16:1组之间贡献的是PMeOH（14:1/16:1）、PE（16:1/18:2）和TAG（18:1/18:1/22:5）;11t18:1组和9t16:1组之间贡献的是TAG（18:1/18:1/22:5）、PI（16:1/18:2）、TAG（18:1/18:2/22:5）和TAG（18:1/18:1/22:6）;CHB组和HHB组之间贡献的是RvD1、C20:4和RvE1;HSO组和CM组之间贡献的是12-HEPE、14-HDHA和PGF2α。此外,它们之间的差异代谢通路都涉及到了花生四烯酸（AA）代谢。由于AA代谢通路的多种下游产物与AS的发生密切相关,其代谢途径中许多分子和受体可作为AS相关疾病治疗的药物靶点,而AS又是CVD最主要的病因,所以本研究后续选取AA代谢通路来进一步研究TFA对LO2细胞脂质代谢的影响。

3、通过western-blot测定TFA和TFA-mixture对LO2细胞磷脂酶A2的影响并探讨了磷脂酶A2（PLA2）与AA代谢通路之间的关系。结果显示,TFA（9t18:1、11t18:1和9t16:1）及其它们的不同比例混合物（HHB、CHB、HSO和CM）均能在一定程度上使得LO2细胞中PLA2（sPLA2、cPLA2和iPLA2）的蛋白表达量增加。此外,TFA还可以激活LO2细胞中AA代谢通路（COX-2、LOX和CYP450）,并且PLA2可以在一定程度上调控TFA诱导下LO2细胞内的AA代谢通路。然而,尽管不同来源的TFA都可以激活PLA2-AA代谢通路,但是在这个过程中,不同分型的PLA2的特异性并不完全一致。

参考文献

[1]Relationship between plasma trans-fatty acid isomer concentrations and self-reported cardiovascular disease risk in US adults[J].Qian Zhang,Yuwei Yang,Mingjun Hu,Haibo Li,Qi Zhong,Fen Huang.International Journal of Food Sciences and Nutrit.2018(8)

[2]Comparison of trans-fatty acids on proliferation and migration of vascular smooth muscle cells[J].Haewon Kim,Chang Hee Jeong,Hong Gu Lee,Sung Gu Han.Food Science and Biotechnology.2017(2)

[3]Omega-3 fatty acids and mortality in patients referred for coronary angiography.The Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health Study[J].Marcus E.Kleber,Graciela E.Delgado,Stefan Lorkowski,Winfried M?rz,Clemens von Schacky.Atherosclerosis.2016

[4]Trans-fatty acids and cardiovascular risk:does origin matter?[J].Dawczynski,Lorkowski.Expert Review of Cardiovascular Therapy.2016(9)

[5]邹倩.基于脂质组学研究反式脂肪酸对人正常肝细胞脂质代谢的影响[D].南昌大学,2020.