重组人血清白蛋白的应用

背景^[1-3]

重组人血清白蛋白一种来源于转基因水稻的重组人血清白蛋白，不含有动物源成分，能为无血清培养基提供更安全的选择。与胎牛血清（FBS）、血浆来源白蛋白（pHSA）和牛血清白蛋白（BSA）相比，OsrHSA具有更高的纯度，更好的批次稳定性。同时，OsrHSA也广泛地在生物医药生产中作赋形剂、稳定剂和包埋剂。人血清白蛋白（HSA）作为人血浆中含量最丰富的蛋白，是激素、脂类等物质的转运载体，其主要生理功能是调节血浆pH值和维持血浆渗透压。

人血清白蛋白作为血浆容量扩充剂用途广泛，是当前的研究热点之一。人血清白蛋白（Human Serum Albumin，简称HSA）是人血浆中的蛋白质。其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。

重组人血清白蛋白

人血清白蛋白是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的50%～60%，浓度达38~48g/L，是人体血浆中最主要的蛋白质，维持机体营养与渗透压，在机体中具有重要的生理功能。肝脏每天约合成12g的白蛋白。HSA属于一种单链无糖基化蛋白质，组成为585个氨基酸，分子量是66.5 kD，等电点介于4.7～4.9。

在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等：同时维持血液正常的渗透压。在临床上人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂。

应用^[4][5]

用于重组人血清白蛋白制备及双抗体夹心ELISA方法的建立研究

人血清白蛋白（Human Serum Albumin,HSA）是一种由肝细胞合成的可溶性单体蛋白质,占血浆总蛋白的60%,具有多种重要的生理功能,同时也是制药工业中不可缺少的辅料之一,作为产品居国际市场血液制剂销售额的首位。目前临床应用的HSA主要从人血液中分离,但由于血源缺乏以及潜在的污染风险,基因重组人血清白蛋白成为替代产品的首选。

利用基因重组的方法,在大肠杆菌中表达了人血清白蛋白,并制备了重组人血清白蛋白的多克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测方法,获得了以下结果：1.采用RT-PCR的方法从人胚肺二倍体细胞中扩增HSA基因,构建pGEX-4T-1-rHSA原核表达载体,并实现HSA在大肠杆菌中的表达。

结果显示：扩增出HSA片段为1755bp,符合预期；构建的pGEX-4T-1-rHSA与NCBI上的HSA（登录号NM000477.5）核苷酸和氨基酸序列同源性均为100%,重组表达载体构建成功；表达产物具有良好的反应原性,能与HSA抗体发生特异性的结合反应。

2. 表达的重组人血清白蛋白经变性、复性及GST琼脂糖凝胶FF亲和层析纯化后作为免疫原免疫家兔,制备HSA多克隆抗体。经丙烯葡聚糖凝胶层析纯化后,应用间接ELISA和Western-blot方法对制备的抗体进行鉴定。结果表明：重组蛋白多数以包涵体的形式存在,分子量大小约为93kD；重组蛋白具有良好的免疫原性；应用其制备的抗血清效价可达到1：100000；纯化的多克隆抗体与表达的重组人血清白蛋白和血浆来源的HSA均能产生特异性结合,具有良好的生物学活性。

3. 利用鼠单抗及制备的兔多抗为基础,初步建立了HSA的双抗体夹心ELISA检测方法；条件为：包被液为0.4μg/mL纯化的兔抗人血清白蛋白多克隆抗体；封闭液为1%牛血清白蛋白；酶标抗体为1：20000稀释的鼠抗人血清白蛋白-HRP；样品反应时间为60min；酶标抗体作用时间为60min；显色时间为15min；该方法特异性及重复性较好,线性检测范围为0.39mg/mL,为建立快速简便的HSA检测方法提供基础。

研究成功构建了HSA原核表达载体,制备了HSA兔多克隆抗体,建立了基于HSA的双抗体夹心ELISA检测方法,为HSA的检测提供一种方法。

参考文献

[1]A novel feeding strategy for enhanced protein production by fed-batch fermentation in recombinant Pichia pastoris[J].A.K Chauhan,D Arora,N Khanna.Process Biochemistry.1999(2)

[2]Inclusion body purification and protein refolding using microfiltration and size exclusion chromatography[J].Boris Batas,Chiara Schiraldi,Julian B.Chaudhuri.Journal of Biotechnology.1999(2)

[3]Physicochemical and Immunochemical Properties of Recombinant Human Serum Albumin from Pichia pastoris[J].Wataru Ohtani,Yoshihito Nawa,Kazuya Takeshima,Hideki Kamuro,Kaoru Kobayashi,Takao Ohmura.Analytical Biochemistry.1998(1)

[4]Cell adhesion molecules and insulin-like growth factor-1 in vascular disease[J].Sandhya K.Balaram,Devendra K.Agrawal,R.Todd Allen,Charles A.Kuszynski,John D.Edwards.Journal of Vascular Surgery.1997(5)

[5]李向茸.重组人血清白蛋白制备及双抗体夹心ELISA方法的建立[D].西北民族大学,2014.