小鼠脂肪细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠脂肪细胞分离自脂肪组织；脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶；贮存的脂肪，在需要时可迅速分解成甘油和脂肪酸，经血液输送到各组织以供利用。

它们影响胰岛素敏感性、血压水平、内皮功能、纤溶活动及炎症反应，参与多种重要病理生理过程；脂肪组织已由过去单纯作为能量储存的器官而成为一个极其重要的内分泌系统。脂肪细胞分为白色脂肪细胞和褐色（棕色）脂肪细胞，常呈白色，在婴幼儿期大量增殖，到青春期数量达到巅峰，此后数星一般不再增加。

细胞内含有大量富含脂肪的小泡，称为脂质泡，富含光面内质网。此外，还有一种褐色脂肪细胞，在动物体内主要存在于肩胛骨间、颈背部、腋窝、纵隔及肾脏周围，含有高度团缩的褐色脂肪，作用是将脂质分解产热，调节体内脂质比例。

小鼠脂肪细胞

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于Adra1a对小鼠白色脂肪细胞分化影响的研究

以小鼠白色脂肪细胞为研究对象通过体外成脂诱导和Adra1a基因过表达技术,探究Adra1a对白色脂肪细胞成脂分化的影响及其作用机制。

结果如下:1、白色脂肪细胞的分离培养及鉴定利用胶原酶消化法分离小鼠白色脂肪细胞,用含10%FBS的DMEM培养液培养,细胞形态呈典型的成纤维细胞样形态,油红O染色后可观察到成熟脂肪细胞内出现许多单泡脂滴,证明本研究分离得到的是典型白色脂肪细胞。

2、Adra1a在白色脂肪细胞成脂分化过程中的表达变化对白色脂肪细胞进行成脂分化,在分化的第2天、4天、6天和8天收集白色脂肪细胞,通过RT-q PCR和Western Blot检测Adra1a在成脂分化过程中的表达变化,发现Adra1a的表达量随着分化时间的延长而降低。

3、Adra1a过表达载体的转染效率及其对细胞活性的影响构建Adra1a过表达载体,利用脂质体转染法将Adra1a过表达载体转染到白色脂肪细胞中,检测转染效率发现该过表达载体可以使Adra1a的表达提高24.8倍。利用CCK-8检测Adra1a过表达对白色脂肪细胞活性的影响,发现转染Adra1a过表达载体后对细胞活性没有显著影响。

4、Adra1a过表达对白色脂肪细胞成脂分化的影响在白色脂肪细胞中转染Adra1a过表达载体并进行成脂诱导,通过RT-q PCR和Western Blot检测成脂诱导相关基因表达量的变化,结果发现成脂标志基因PPARγ在转录及蛋白水平表达量显著下调。利用油红O染色及脂滴定量检测Adra1a过表达后白色脂肪细胞的成脂情况,发现Adra1a过表达可抑制白色脂肪细胞成脂分化过程脂滴积累。

5、Adra1a对白色脂肪细胞分化信号通路的影响转染Adra1a过表达载体后,检测白色脂肪细胞分化后AMPK和ERK/MAPK及其磷酸化水平的变化,结果发现,Adra1a过表达后AMPK水平变化不大,但其磷酸化水平明显提高。而ERK的表达水平也无变化,其磷酸化水平也明显提高。证实Adra1a可能通过提高AMPK和ERK通路的磷酸化水平来抑制白色脂肪细胞的分化。

参考文献

[1]The phytochemical hyperforin triggers thermogenesis in adipose tissue via a Dlat-AMPK signaling axis to curb obesity.[J].Chen Suzhen,Liu Xiaoxiao,Peng Chao,Tan Chang,Sun Honglin,Liu He,Zhang Yao,Wu Ping,Cui Can,Liu Chuchu,Yang Di,Li Zhiqiang,Lu Junxi,Guan Jian,Ke Xisong,Wang Renxiao,Bo Xiaohai,Xu Xiaojun,Han Junfeng,Liu Junli.Cell metabolism.2021(3)

[2]The colors of adipose tissue.[J].Frigolet María E,Gutiérrez-Aguilar Ruth.Gaceta medica de Mexico.2020(2)

[3]White adipose tissue mitochondrial metabolism in health and in obesity.[J].Heinonen Sini,Jokinen Riikka,Rissanen Aila,Pietil?inen Kirsi H.Obesity reviews:an official journal of the International Association for the Study of Obesity.2020(2)

[4]Adipokine FABP4 integrates energy stores and counterregulatory metabolic responses[J].Journal of Lipid Research.2019(4)

[5]杨楠.Adra1a对小鼠白色脂肪细胞分化影响的研究[D].内蒙古大学,2021.