兔子D二聚体(D2D)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

兔子D二聚体(D2D)ELISA KIT可以定量测定兔血清、血浆或其它相关生物液体中D2D含量。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗D2D抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗D2D抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的D2D呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

兔子D二聚体(D2D)ELISA KIT

兔子D二聚体(D2D)ELISA KIT操作步骤：

1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于D-二聚体及Sox2在ANCA相关性血管炎肾受累中的水平及意义研究

D-二聚体是交联纤维蛋白水解后产生的特异性降解产物,是继发性纤溶亢进的标志物,其循环水平升高已广泛用于判断血栓栓塞形成风险的生物学标志物。近年来,D-二聚体在自身性免疫疾病中的作用逐渐成为人们关注的焦点。研究报道,在类风湿性关节炎（rheumatic arthritis,RA）患者滑膜液和血清中D-二聚体水平显著增加,且增高的D-二聚体能在一定程度上反映疾病的活动度和评估患者预后。又有证据显示,循环D-二聚体水平与系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者的疾病活动度以及肾损害的严重程度有关,是评估SLE活动度的新型标志物。

方法:纳入确诊为AAV肾损害的患者50例,收集其临床及肾脏病理资料。诊断标准:符合2012年美国Chapel Hill Consensus Conference（CHCC）系统性血管炎诊断标准及1999年美国风湿病学血管炎诊断标准。以血浆D-二聚体水平的中位数（3.17mg/L FEU）为截点值将AAV患者分成高、低水平两组,比较两组患者的一般资料及生物学特征、肾脏病理资料及生存预后,并进行D-二聚体水平与临床指标的相关性分析,通过ROC曲线比较血浆D-二聚体、血清CRP、血清IL-6水平评估AAV患者活动性的诊断效能。

结果:1.D-二聚体高水平组AAV患者C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、白介素-6（interleukin 6,IL-6）水平及BVAS评分高于D-二聚体低水平组（P值分别为0.001、0.015、0.055）,24小时尿蛋白定量、血清白蛋白（albumin,Alb）低于D-二聚体低水平组（P值分别为0.031、0.006）;

2. 血浆D-二聚体水平与BVAS（r=0.322,P=0.022）、CRP（r=0.573,P<0.001）、IL-6（r=0.341,P=0.015）、TNF-α（r=0.343,P=0.015）呈正相关。

3. ROC曲线分析显示,血浆D-二聚体水平评估AAV患者活动性的AUC为0.707,P=0.174,95%CI（0.471,0.942）;血清CRP水平评估AAV患者活动性的AUC为0.700,P=0.198,95%CI（0.491,0.900）;血清IL-6水平评估AAV患者活动性的AUC为0.633,P=0.381,95%CI（0.463,0.803）;

4. 两组患者间肾小球总数、正常肾小球的百分比、球性硬化发生率无显著性差异（P>0.05）;相较于高组患者,D-二聚体低水平组中球性硬化百分比较高（P=0.002）,新月体形成的患者数量较少（P=0.247）。D-二聚体高水平组中细胞性新月体形成的患者数较低水平组多（P=0.017）,且百分比高于低水平组（P=0.027）。两组间纤维性新月体形成无统计学差异（P>0.05）;

5.血浆D-二聚体评估AAV患者有无新月体的AUC为0.699,P=0.076,95%CI（0.448,0.951）;进一步对新月体种类进行分层分析,发现评估细胞性新月体的AUC为0.755,P=0.010,95%CI（0.559,0.952）;评估纤维性新月体的AUC为0.470,P=0.731,95%CI（0.304,0.636）。6.Kaplan-Meier生存分析显示两组间的肾脏累积生存率无显著性差异（P=0.392）。

参考文献

[1]Citrullinated Histone H3:Early Biomarker of Neutrophil Extracellular Traps in Septic Liver Damage[J].Kozo Nomura,Tomoharu Miyashita,Yasuhiko Yamamoto,Seiichi Munesue,Ai Harashima,Hideo Takayama,Sachio Fushida,Tetsuo Ohta.Journal of Surgical Research.2019

[2]Investigations in systemic vasculitis–The role of renal pathology[J].Annelies E.Berden,Maria A.C.Wester Trejo,Ingeborg M.Bajema.Best Practice&Research Clinical Rheumatology.2018

[3]Biology,role and therapeutic potential of circulating histones in acute inflammatory disorders[J].Peter Szatmary,Wei Huang,David Criddle,Alexei Tepikin,Robert Sutton.Journal of Cellular and Molecular Medicine.2018(10)

[4]ADAMTS13:origins,applications,and prospects[J].William E.Plautz,Jay S.Raval,Mitchell R.Dyer,Marian A.Rollins‐Raval,Brian S.Zuckerbraun,Matthew D.Neal.Transfusion.2018(10)

[5]刘星.D-二聚体及Sox2在ANCA相关性血管炎肾受累中的水平及意义[D].中国人民解放军陆军军医大学,2019.