人胆囊癌细胞的应用

背景^[1-3]

人胆囊癌细胞是从一位61岁的男性低分化胆囊癌患者中建立的；GBC-SD细胞的形状有多边形、纺锤形和正方形；GBC-SD细胞能分泌CEA和CA19-9。GBC-SD细胞倍增时间大约为21.4小时，可移植到裸鼠，生成的肿瘤与原发肿瘤相似。

人胆囊癌细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入4mL培养基混合均匀。在800-1000RPM条件下离心4-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养，补加培养基至6ml。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:4的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于青蒿琥酯联合5-氟尿嘧啶对人胆囊癌细胞作用的实验研究

研究青蒿琥酯和5-FU对人胆囊癌细胞的增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响,比较两种药物对细胞的作用强度,探究青蒿琥酯在治疗胆囊癌中的应用前景。

方法：用CCK-8法来检测青蒿琥酯和5-FU的OD值并计算半数抑制浓度（IC50）值;使用EdU-488法和克隆形成实验用来测定青蒿琥酯和5-FU对细胞增殖的影响;细胞划痕实验用来测定青蒿琥酯和5-FU单用和联用对细胞迁移的影响;使用Annexin V和PI双标法标记细胞,使用流式细胞仪用来测定青蒿琥酯和5-FU单用和联用诱导细胞凋亡发生的情况;使用PI单标法标记细胞,使用流式细胞仪来测定青蒿琥酯和5-FU单用和联用对细胞周期的影响情况。

结果：CCK-8法显示选取48h的OD值数据计算得出的结果作为青蒿琥酯的IC50值,IC50=43.7μmol/L,5-FU的IC50=28.1μmol/L。在24h和48h观察时间点内,与对照组相比,5-FU组和青蒿琥酯组对细胞的增殖能力有抑制作用。EdU-488法显示与对照组相比,5-FU组和青蒿琥酯组以及两药联合作用组对细胞的增殖有抑制作用。细胞划痕的结果显示与对照组相比,5-FU组和青蒿琥酯组以及两药联合组对细胞的迁移能力有抑制作用。

Annexin V和PI双标法检测5-FU组和青蒿琥酯组以及两药联合组诱导细胞凋亡的能力显示与对照组相比,5-FU组和青蒿琥酯组以及两药联合组对细胞的凋亡发生有明显促进作用。PI单标法用来检测细胞的细胞周期,5-FU组、青蒿琥酯组以及在两药联合作用组时显示与对照组相比,5-FU组、青蒿琥酯组以及两药联合组能抑制细胞的S期和G2/M期。

结论：1.青蒿琥酯在体外可抑制GBC-SD胆囊癌细胞的增殖、凋亡;2.在体外实验中,青蒿琥酯和5-FU联用较青蒿琥酯单用抗肿瘤的效果更好;3.在体外实验中,青蒿琥酯和5-FU联用较5-FU单用抗肿瘤的效果更好;4.在体外实验中,青蒿琥酯抗肿瘤的效果弱于5-FU抗肿瘤的效果。

参考文献

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[3]Artemisinins as a novel anti-cancer therapy:Targeting a global cancer pandemic through drug repurposing[J].Augustin Yolanda,Staines Henry,Krishna Sanjeev.Pharmacology&Therapeutics.2020(prep)

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[5]洪茂林.青蒿琥酯联合5-氟尿嘧啶对人胆囊癌细胞作用的实验研究[D].昆明医科大学,2021.