MDCK狗肾转化细胞的应用

背景^[1-3]

MDCK狗肾转化细胞是S.H.MADIN于1958年9月建成，来源于考克斯班尼犬肾脏，该肾脏细胞原代培养时其形态类似于成纤维细胞，经过胰蛋白酶和EDTA混合消化液的连续6次消化法纯化而上皮样细胞，每次纯化间隔时间为7D。培养中MDCK细胞具有远段肾小管与集合管，来源细胞的分化特性。MDCK细胞株至少有两种细胞类型，一种命名为C5A，其在含I型胶原的培养物中生长时，能分泌液体，导致囊肿形成，但在塑料面的培养低物上培养时，能分泌液体，却不能形成囊肿，另一种细胞正好相反。

MDCK狗肾转化细胞

MDCK细胞被广泛用作远曲小管或集合管的模型，还可用于代谢研究和Pg级药物与药物相互作用研究以及观察流感病毒株对细胞功能的影响。

MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：呼肠孤病毒)、腺病毒、 犬细小病毒、猫粒细胞缺乏症病毒)及禽流感病毒等。由于其 病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。

传统的MDCK细胞培养大多采用有血清贴壁培养方式。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以有效地促进细胞生长和产物表达。

细胞培养步骤：

1、培养基及培养冻存条件准备

1）准备MEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于基于MDCK细胞高密度培养的甲型流感病毒疫苗生产工艺开发与优化研究研究

通过考察微载体和血清对细胞生长的影响以及感染参数对病毒生产效率的影响,确定了基于MDCK细胞培养的流感疫苗生产的基本工艺。

研究表明,Cytodex-1和Cytodex-3两种微载体均能支持MDCK细胞正常贴附生长,胎牛血清(FBS)支持细胞生长的作用显著优于新生小牛血清(NBS)。以2 g/L浓度的Cytodex-1或3 g/L的Cytodex-3为贴附基质,以DMEM为基础培养基,添加7.5%(v/v)的FBS便能确保MDCK细胞正常生长,细胞密度可达5.50×106 cells/ml;事关流感病毒感染复制的三个关键参数TPCK-胰酶浓度、MOI和TOI均对病毒增殖具有显著影响,采用5.0 mg/L的TPCK-胰酶浓度、0.01的MOI和72 h的TOI较为适宜；据此建立了基于MDCK细胞生物反应器培养的流感病毒基本生产工艺,流感病毒HA滴度值达到210.13±0.18 HA units/50μl,单位细胞病毒产率Svy为(6.09±0.44)×103virions/cell。

上述生产工艺虽可满足工业化生产的基本需求,但其生产效率仍有较大提升空间。为了进一步提高生产效率,本文继而通过考察维持培养基的关键组分对产毒期MDCK细胞密度维持、代谢和病毒增殖的影响,分析了病毒增殖过程对营养代谢的需求,进一步优化了维持培养基。

研究表明产毒期的换液操作可显著提高单位细胞的病毒产率,由此可知在细胞产毒阶段改善培养环境的营养供给对病毒高效增殖尤为重要。

参考文献

[1]Insights into pH‐induced metabolic switch by flux balance analysis[J].Marija Ivarsson,Heeju Noh,Massimo Morbidelli,Miroslav Soos.Biotechnol Progress.2015(2)

[2]The intricate interplay between RNA viruses and NF-κB[J].M.Lienhard Schmitz,Michael Kracht,Vera V.Saul.BBA-Molecular Cell Research.2014(11)

[3]An Unstructured Model of Metabolic and Temperature Dependent Cell Cycle Arrest in Hybridoma Batch and Fed-Batch Cultures[J].D.G.García Münzer,M.Ivarsson,C.Usaku,T.Habicher,M.Soos,M.Morbidelli,E.N.Pistikopoulos,A.Mantalaris.Biochemical Engineering Journal.2014

[4]Exploring the early stages of the pH‐induced conformational change of influenza hemagglutinin[J].Yu Zhou,Chao Wu,Lifeng Zhao,Niu Huang.Proteins.2014(10)

[5]黄锭.基于MDCK细胞高密度培养的甲型流感病毒疫苗生产工艺开发与优化[D].华东理工大学,2016.