BNL CL.2 小鼠胚胎肝细胞的应用

背景^[1-3]

BNL CL.2小鼠胚胎肝细胞是在用鸟氨酸和苯丙氨酸代替精氨酸和酪氨酸的平板上选择建立的细胞株；检测表明，BNL CL.2细胞肢骨发育畸形病毒(鼠痘)阴性。

生长培养基DMEM高糖＋10%FBS＋1%P/S，培养条件气相：空气95%；CO2 5%，温度：37℃。

BNL CL.2小鼠胚胎肝细胞

细胞处理方法:

1、贴壁生长的细胞用T25细胞培养瓶发货,收到细胞后,拆开包装T25瓶的自封袋,不拆封口膜,表面喷75%酒精消毒。

2、消毒后用显微镜观察细胞状态,并拍下细胞照片。

3、将细胞放入37度培养箱平衡两小时以上,平衡是为了让细胞尽快适应培养箱环境。

4、平衡后将T25瓶中培养基吸出用离心管装好备用。

5、如细胞密度高于80%,可以直接消化传代,相反则加入5-6mL培养基放回培养箱继续培养即可。

细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

应用^[4][5]

用于鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究

改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。

方法：1、购清洁级别近交系孕15天SD大鼠,利用械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进行进一步的纯化,得到较为纯化的肝干细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化。

2、将卵圆细胞接种于预先用0.2%明胶处理的盖玻片上置于24孔培养板中,37℃,5%CO2孵箱培养24小时,至细胞长成单层后行免疫荧光化学检测。细胞消化传代,对P10代细胞进行免疫组织化学检测。分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物CD34、C-Kit、0V6、CK19的表达情况结果分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁,5d后细胞体积增大,呈梭形或多边形。经1-2次差异性消化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示：P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白（AFP）抗原、OV6、细胞角蛋白（CK）19呈阳性表达,不表达ALB。P10代肝干细胞C-Kit、CK19、OV-6及CD34呈阳性表达。

结论：此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为深入研究肝干细胞生物学特性和进行体内移植实验提供了物质基础。

大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用背景长期以来,成熟肝细胞和卵圆细胞在损伤肝的再生中如何发挥作用一直是肝干细胞研究领域的核心问题,对两者在损伤肝再生中的作用也有着不同的观点。

一方面,有报道认为部分肝切除（partial hepatectomy,PH）后大鼠肝可在二周内再生并恢复至原来大小,有人连续进行了12次PH后发现仍能完成肝再生：这种肝再生多被认为是单独由成熟肝细胞分裂增殖完成的。另一方面,在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区小胆管和Hering’s管的卵圆细胞（OVC）被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞。

参考文献

[1] Therapeutic application of stem cells in gastroenterology:An up-date[J].Patrizia Burra,Debora Bizzaro,Rachele Ciccocioppo,Fabio Marra,Anna Chiara Piscaglia,Laura Porretti,Antonio Gasbarrini,Francesco Paolo Russo.World Journal of Gastroenterology.2011(34)

[2] Activation of Notch1 signaling by marrow-derived mesenchymal stem cells through cell–cell contact inhibits proliferation of hepatic stellate cells[J].Si Chen,linan Xu,Nan Lin,Weidong Pan,Kunpeng Hu,Ruiyun Xu.Life Sciences.2011(25)

[3]An Update on Hepatic Stem Cells:Bench to Bedside[J].N.Parveen,A.K.Aleem,M.A.Habeeb,C.M.Habibullah.Current Pharmaceutical Biotechnology.2011(2)

[4]In Vivo Differentiation of Magnetically Labeled Mesenchymal Stem Cells Into Hepatocytes for Cell Therapy to Repair Damaged Liver[J].Shenghong Ju,Gao-Jun Teng,Haihua Lu,JiYang Jin,Yu Zhang,Aifeng Zhang,Yicheng Ni.Investigative Radiology.2010(10)

[5]王亚萍.鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究[D].南方医科大学,2013.