基因敲除小鼠的制备流程

基因敲除小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型，在生命科学、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用。基于胚胎干细胞的基因打靶技术、EGE技术（基于Crispr cas9技术）是当下比较火热的基因敲除小鼠制备技术。利用这两种技术制备基因敲除小鼠的流程是什么样的？

一、基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠的流程：

1、课题设计，订购课题BAC菌；

2、按照课题设计，完成打靶载体设计和构建；

3、将重组载体电转到胚胎干细胞中，用G418筛选转染后的胚胎干细胞，得到阳性克隆；

4、进一步通过PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对上一步得到的阳性克隆进行筛选，得到稳定整合外源基因的胚胎干细胞阳性克隆；

5、将胚胎干细胞阳性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫内；

6、得到嵌合鼠，并获得F1阳性杂合子小鼠。

基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠是目前为止唯一一个可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术，但目前只应用在小鼠的基因敲除上，而且其周期长工作量大。

二、利用EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠的流程：

设计构建识别靶序列的sgRNA;

设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒；

利用百奥赛图自主开发的UCA试剂盒对sgRNA/Cas9进行活性检测；

设计构建打靶载体；

体外转录sgRNA/Cas9 mRNA;

小鼠受精卵原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体；

获得Fo代小鼠，利用PCR对Fo代小鼠进行基因型鉴定；

获得F1代小鼠，利用PCR和southernblot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对F1代小鼠进行基因型鉴定。

虽然EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠看似比基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠流程繁琐，其实不然，EGE技术（基于Crispr cas9技术）系统构建简单，基因敲除/敲入效率高，速度快，可实现多基因、多物种基因敲除/敲入，最快2个月即可得到F0代阳性鼠，5个月得到F1代杂合子小鼠。