人虹膜色素上皮细胞的应用

背景^[1-3]

人虹膜色素上皮细胞提取于人虹膜组织，于原代冻存。每管含有细胞数>5×105cells/ml，此细胞通过Cytokeratin-18,Vimentin和Fibronectin免疫荧光染色验证，经测试不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。培养至第二代时，细胞可以达到大约10倍增。

虹膜是一个孔径可变，有颜色的圆盘状物，形成眼睛的瞳孔。鳞片状的上皮细胞覆盖其前表面，双层有颜色的上皮细胞覆盖其后表面。虹膜色素上皮细胞与视网膜色素上皮细胞具有相同的功能特性，比如噬菌作用，降解杆体外节和合成营养因子。近年来，虹膜色素上皮细胞已被移植到视网膜下间­隙来治疗视网膜色素上皮细胞缺乏。移植后的巩膜色素上皮细胞可存活数月。移植后的IPE将与固有的RPE在视网膜下腔逐渐发生重塑。细胞的反应是巨噬细胞浸润，这与视网膜色素上皮细胞移植后表现相似。体外研究还表明，虹膜色素上皮细胞表达CD86，通过直接与细胞毒性T4淋巴细胞相关抗原相结合来抑制T细胞活性。

人虹膜色素上皮细胞

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于PEDF基因修饰色素上皮细胞对脉络膜新生血管作用的体外研究

分离、培养和纯化原代视网膜（RPE）和虹膜色素上皮细胞（IPE）,比较RPE与IPE的生物学特性。分离和培养原代脉络膜毛细血管内皮细胞（CEC）,建立脉络膜新生血管体外模型。通过体外实验的方法研究色素上皮源性因子（PEDF）及PEDF基因修饰的色素上皮细胞对脉络膜新生血管的作用。

方法:采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE细胞,进行体外培养,密度梯度离心法纯化,免疫组化的方法进行鉴定。观察比较RPE、IPE细胞的超微结构、生长状况,RT-PCR方法检测与RPE功能密切相关的几种蛋白质mRNA的表达。

采用磁分选技术分离培养原代的脉络膜毛细血管内皮细胞,用Ⅳ型胶原铺板,诱导细胞分化、连接形成血管样结构。用脂质体介导基因转染法将人PEDF基因导入体外培养的虹膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞,利用质粒包含的抗稻瘟菌素的耐药性基因筛选稳定表达PEDF的色素上皮细胞株。RT-PCR鉴定PEDF在细胞内的表达;ELISA方法检测细胞分泌PEDF的水平。

采用CulLure Insert共培养PEDF基因修饰的色素上皮细胞和CEC细胞,观察PEDF对有或无血管内皮生长因子（VEGF）刺激条件下CEC的增生、移行和血管样结构的形成的影响效应;ELISA方法检测共培养细胞上清液中VEGF浓度。结

果:纯化后体外培养牛RPE细胞和IPE细胞的角蛋白表达强阳性。原代培养的牛RPE、IPE细胞外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量的色素颗粒、内质网,RPE细胞还含有许多与其吞噬功能相适应的溶酶体。RT-PCR显示RPE和IPE细胞均有视黄醛结合蛋白（CRALBP）、维生素A结合蛋白（RBP）、11-顺视黄醛脱氢酶（11-cis RDH）和组织蛋白酶D（CathepsinD）的mRNA表达。

采用CD31抗体包被的磁珠分离培养的细胞在特殊培养基下生长良好,V-W因子表达阳性,证实为毛细血管内皮细胞。在Ⅳ型胶原的诱导下,细胞生长逐渐形成血管样结构。浓度100ng/mL～1000ng/mL PEDF对20ng/mL的VEGF刺激下CEC细胞的增生、移行有抑制作用（P<0.05）,加入PEDF抗体后,能够阻断其抑制作用。

参考文献

[1]Retinal transplants restore visual responses:trans‐synaptic tracing from visually responsive sites labels transplant neurons[J].Magdalene J.Seiler,Biju B.Thomas,ZhenhaiChen,RongjuanWu,Srinivas R.Sadda,Robert B.Aramant.European Journal of Neuroscience.2008(1)

[2]Neural Regeneration and Cell Replacement:A View from the Eye[J].Deepak Lamba,Mike Karl,Thomas Reh.Cell Stem Cell.2008(6)

[3]Characterization of Müller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration[J].Ryan Thummel,Sean C.Kassen,Jennifer M.Enright,Craig M.Nelson,Jacob E.Montgomery,David R.Hyde.Experimental Eye Research.2008(5)

[4]Pharmacological disruption of the outer limiting membrane leads to increased retinal integration of transplanted photoreceptor precursors[J].E.L.West,R.A.Pearson,M.Tschernutter,J.C.Sowden,R.E.MacLaren,R.R.Ali.Experimental Eye Research.2008(4)

[5]汪枫桦.PEDF基因修饰色素上皮细胞对脉络膜新生血管作用的体外研究[D].复旦大学,2005.