假单胞菌的用途

背景^[1][2]

假单胞菌在自然界分布广泛，种类繁多，是植物根际土壤周围起生物防治功能的主要细菌类群。目前，世界各地对假单胞菌的应用研究有了大量的报道，涉及领域包括用于农业生物防治、植物生长调节、环境保护和医药开发等，其中，在生物防治与促植物生长方面的研究最为透彻、应用最为广泛，生物防治主要作用对象为植物病原真菌，如雪霉叶枯菌、镰刀菌、棉花黄萎病菌、炭疽菌等。

另外，假单胞菌还可用于生物杀虫，已分离到的具有杀虫活性的次级代谢产物有oxazoles、鼠李糖脂等。假单胞菌对植物生长的促进作用主要通过其产生的植物生长激素。在环境保护方面，假单胞菌主要被用于化学农药的降解、废水处理、油污处理等。

假单胞菌用于医药方面的研究已有报道，国外较早时期有从假单胞菌中分离出具有抗肿瘤活性的大环类酯类化合物OximidinesI 和II，并有利用假单胞菌外毒素与单克隆抗体结合抗肿瘤的报道；在我国，早期分离到济南假单胞菌对肿瘤具有一定的抑制作用，从怀地黄中分离到的绿针假单胞菌对食管癌细胞具有细胞毒性。

随着对假单胞菌的研究不断深入，特别是全基因组测序的完成，假单胞菌的许多生物功能得到开发与利用，在农业、环保和医药领域具有广阔的应用前景，从自然界中分离新的假单胞菌是充分利用该细菌的基础。

分类^[2]

目前，应用较广泛的是Palleroni1993 根据DNA-rRNA 同源性研究提出的组群。其将假单胞菌分为20 个种59 个致病变种。事实上，该属内的成员包含数百种之多，十分复杂，是一个异质性很强的属。植物病原假单胞菌根据是否产生荧光色素又可分成2 大类，即荧光群和非荧光群。在植物病害中较重要的有茄青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)和丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)。

前者属非荧光菌，植物青枯病是世界性分布病害，用生物因子防治青枯病取得了良好的效果；而后者则为典型的荧光菌。丁香假单胞菌的分类已经争论了40 多，在伯杰氏系统细菌学手册(Bergey′s Manual of SystematicBacteriology)版中，丁香假单胞菌的分类被修正，将41 个定名的种作为丁香假单胞菌的致病变种。

1）根据与假单胞菌属rRNA的关系确定应转移到其它已存在的属或新属中的有：贝氏假单胞菌(P .beijerincki i)，甜菜假单胞菌(P .beteli)、北城假单胞菌(P .boreopol is)，氢碳酸假单胞菌(P .carboxydohydrogena)，杜氏假单胞菌(P .doudorof f i)，刺状假单胞菌(P .echinoids)，伸长假单胞菌(P .elongata)，弯曲假单胞(P .geniculata)，格氏假单胞菌(P .glathei)，栖木假单胞菌(P .hibiscicola)，哈特假单胞(P .huttiensis)，勒氏假单胞菌(P .lemoignei)，航海假单胞菌(P .naut ica)，穿孔素假单胞菌(P .pertucinogena)，吩嗪假单胞菌(P .phenazinium)，皮克特假单胞菌(P .pictorum)，吡咯假单胞菌(P .pyrrocinia)，嗜糖假单胞菌(P .saccharophi la)和蒲桃假单胞菌(P .syzygi i)。

系统发育仍未确定的假单胞菌有：抗微生物假单胞(P .antimicrobica)，桔黄假单胞菌(P .aurantiaca)，产氮假单胞(P .azotoformans)，青紫葛假单胞菌(P .cis-sicola)，弯曲假单胞菌(P .f lectens)，黄褐假单胞菌(P .fulva)，石花菜假单胞菌(P .gelidicola)，嗜盐假单胞菌(P .halophi la)，产靛假单胞菌(P .ndigofera)，懒惰假单胞菌(P .iners)，柳叶刀形假单胞菌(P .lanceolata )，臭味假单胞菌(P .mephit ica)，硝酸基还原假单胞菌(P .nit roreducens)，多刺激假单胞菌(P .sphinosa)，稻草假单胞菌(P .straminae)。

根据与假单胞菌间的DNA-DNA 同源水平很低而新建了2 个属：金色假单胞菌(Chryseomonas)和黄色假单胞菌属(Flav imonas)。但认为这3 个属在次极水平上是相同的。

2）根据16S rRNA 序列的研究对假单胞菌属分类如下：首先分成以下7 个组：P .syringae (丁香假单胞菌组)、P .chlororaphis(绿针假单胞菌组)、P .f luorescens(荧光假单胞菌组)、P .putida (恶臭假单胞菌组)、P .stut zeri(施氏假单胞菌组)、P .aeruginosa (铜绿假单胞菌组)、P .pertucinogena(穿孔素假单胞菌组)。

其中，丁香假单胞菌组包括：扁桃假单胞菌(P .amygdali)、榛色假单胞菌(P .avel lanae)、番木瓜假单胞菌(P .caricapapayae)、菊苣假单胞菌(P .cichorii)、无花果假单胞菌(P .f icuserectae)、苦楝假单胞菌(P .meliae)、萨氏假单胞菌(P .savastanoi)、丁香假单胞菌(P .syringae)、绿黄假单胞菌(P .vi ridi f lav a)。绿针假单胞菌组包括：桔黄假单胞菌(P .aurantiaca)、绿针假单胞菌(P .chlororaphis)、霉实假单胞菌(P .f ragi)、隆德假单胞菌(P .lundensis)、腐臭假单胞菌(P .taet rolens)。

荧光假单胞菌组包括：产氮假单胞菌(P .azotoformans)、P .cedrel la 、皱缩假单胞菌(P .corrugata)、荧光假单胞菌(P .f luorescens)、P .gessardi i 、P .libaniensis 、边缘假单胞菌(P .marginalis)、P .migulae 、霉味假单胞菌(P .mucidolens)、P .oriental is 、罗氏假单胞菌(P .rhodesiae)、类黄假单胞菌(P .synxantha)、托氏假单胞菌(P .tolaasii)、韦龙氏假单胞菌(P .veroni i)。恶臭假单胞菌组包括：黄褐假单胞菌(P .fulva)、蒙氏假单胞菌(P .montei lii)、P .mosselii 、恶臭假单胞菌(P .put ida)。

施氏假单胞菌组包括：巴利阿里假单胞菌(P .balearica)、施氏假单胞菌(P .stut zeri)。铜绿假单胞菌组包括：病鳝假单胞菌(P .angui lliseptica)、产碱假单胞菌(P .alcal igenes)、香茅醇假单胞菌(P .cit ronellolis)、变黄假单胞菌(P .f lavescens)、多门萨假单胞菌(P .mendocina )、硝基还原假单胞菌(P .nitroreducens)、食油假单胞菌(P .oleovarans)、类产碱假单胞菌(P .pseudoalcaligenes)、食树假单胞菌(P .resinovorans)、稻草假单胞菌(P .straminae)。

穿孔素假单胞菌组包括：脱氮假单胞菌(P .denit ri -f icans)、穿孔素假单胞菌(P .pertucinogena)。未分组的假单胞菌包括：伞菌假单胞菌(P .agarici)、P .j isseni i 、铁角蕨假单胞菌(P .asplenii)、褐鞘假单胞菌(P .fuscovaginae)。

规格及用法用量^[3]

注射剂：120亿个菌/2ml。胸腔内注射：先尽量抽净胸水后，取本品2～4ml，用10～20ml生理盐水稀释，注入胸腔内，然后让病人平卧，变换体位，使药物与胸膜腔均匀接触，每周重复1次，2～3次为1个疗程。

应用^[3]

主要用于恶性肿瘤引起胸腔积液的治疗。

药理作用 ^[3]

本品为一种免疫佐剂，对免疫系统有促进作用，使巨噬细胞功能增强，并产生特异性抗体，对动物转移瘤有明显抑制作用，还可诱导机体产生干扰素及肿瘤坏死因子等。瘤体注射，可使肿瘤缩小，其机制是细菌内毒素活化巨噬细胞而产生肿瘤坏死因子，此因子选择性地使肿瘤细 胞坏死而不破坏正常组织。

不良反应^[3]

治疗剂量对心、肝、肾功能无损害，胸腔内给药后可有发热、寒颤，部分患者有胸痛，少数人有轻度胃肠道反应，如恶心、呕吐等。对发热38℃以上、心血管疾病(特别是冠心病)、过敏体质、肝肾功能明显异常者禁用，对老年、体弱者慎用。

其他用途^[4]

假单胞菌具有杀虫、改善植物营养、降解有毒物质、产生抗生素和植物生长调节物质、改善植物微环境和诱导系统抗性等生物防治作用，其产品开发对象包括微生物活菌制剂、抗生素及其基因等。

1. 假单胞菌防治害虫作用

类产碱假单胞菌为昆虫病原菌，对草地蝗虫和竹蝗等具有良好的致死作用，其杀虫作用主要靠产生蛋白质。从类产碱假单胞菌代谢分泌物中分离到1 种杀虫蛋白，含1 种亚基，其分子量为25100 道尔顿，等电点5.16，含17 种氨基酸(其中谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低)，吸收峰为278，在pH 值6 .0 ～ 10 及40 ℃以下杀虫蛋白的活性稳定，对胃蛋白酶敏感，对胰蛋白酶不敏感，不具溶血性。

对类产碱假单胞菌代谢所产生的有较强毒杀蝗虫作用的杀虫蛋白进行二级结构含量研究分析表明，β 折叠含量为58 %，无规卷曲为34 %，酪氨酸残基大部分暴露在分子表面，少部分埋藏于疏水环境中。

以荧光假单胞菌(Pseudomonas f luroscens)P303 为出发菌株，导入Baci llus thuringiensis(Bt)的杀虫基因后，获得遗传工程荧光假单胞菌IPP202，而IPP202 在抑菌、定殖等有益于植物的优良特性方面并未发生显著变化，且在广波长紫外线照射2h 后该工程菌的杀虫活变化较小，田间杀虫活性与Bt 野生菌株接近，有望解决Bt 本身存在的杀虫蛋白多以裸露晶体形式存在而易受紫外线破坏的弱点，并发挥了P303 菌株可定殖多种植物的优点，使其在植物上大量繁殖而起到杀虫作用。

2. 假单胞菌对植物病害的生物防治作用

1)抗生作用。抗生素吩嗪酸(PCA)和2，4-二乙酰滕黄酚(Ph1)为荧光假单胞菌2 种最典型的次生代谢产物，对防治由小麦全蚀病菌Gg t引起的小麦全蚀病有重要作用。已报道的由假单胞菌产生的吩嗪抗生素有1-羧基吩嗪和1-羟基吩嗪。硝吡咯菌素作为另1 种假单胞菌抗生素已被开发用作农用杀真菌剂。滕黄绿脓菌素系Stipanovic 从棉苗根围分离的荧光假单胞菌Pf-5 菌株所产生的抗生素，对由Pythium ultimum 与Rhizoctonia solani 引起的棉苗期猝倒病有较好保护作用。

Gut terson 等和How ie and Suslow 分别在棉花根际分离到1 株P.f luorescens，能产生卵霉素A 抑制Py thiumultimum 的生长。Gill and Warren 从棉花根际分离到1 株Fluorescent Pseudomonad，能产生假单胞杆菌素抑制P.ultimum 的生长。

Linderg 从棉花根际土壤中分离到1 株Fluorescent Pseudomonad，能产生环庚三烯酚酮抑制Helminthosporum cy nodont is 的生长。Dahiy a 从油菜根际土壤中分离到1 株Fluorescent Pseudomonad，能产生脓青素抑制Rhizoctonia solani 的生长以及另1 种具有生物防治作用的2-acetamidophenol(AAP)物质.

2)嗜铁素。Fe3 +的运输基本依靠高亲和铁的螯合体产物绿脓菌素(假单胞菌素)和水杨酸以及对金属具低亲和力的绿脓菌素螯合蛋白，这些能与Fe3 +特异性结合的化合物称为嗜铁素。故拥有1 种对异源嗜铁素的受体能在根际获得竞争优势。

病原微生物本身不能产生嗜铁素或产生很少，所产生的嗜铁素也被假单胞菌所利用，而假单胞菌能产生嗜铁素，并且不被病原微生物所利用，这样病原微生物由于缺Fe 而能生长繁殖。发现假单胞菌(Pseudomonas sp .)JKD-2 在无Fe 环境下能分泌高亲和力的Fe 载体，在低Fe条件下Fe 载体的分泌量减少，而在富Fe 环境下则不能分泌，结果显示菌株JKD-2 在无Fe 条件下分泌的Fe载体，能在低Fe 条件下抑制稻瘟病菌(Piricularia orzae)的生长。

3)细菌的竞争与定殖。微生物之间竞争包括营养竞争和位点竞争，假单胞菌的强竞争能力是其发挥生物防治作用的关键，而微生物在根圈的成功定殖才能真正发挥生物防治价值。从韭菜根内分离出荧光假单胞菌P.f luorcescens DE1，通过拌种和拌培养土回接韭菜表明P.f.NKDE2 能定殖于韭菜根表、根内和根围。恶臭假单胞菌P.put ida P861(Gus)可在油菜根部定殖，且接种3～6d 后定殖密度达值，之后减少并保持稳定水平。

4)HCN 与酶的作用。多种荧光假单胞菌生物防治菌株均能产生HCN，作为1 种生物杀菌剂(生物农药)有助于抑制烟草黑根腐病害。微生物分泌的酶对物质进行降解，既可给植物提供营养，又可减少植物病害的发生。假单胞菌可产生包括几丁质酶在内的多种酶，几丁质酶具分解真菌细胞壁的特性。

5) 单胞菌株B8。从土样中分离到1 株产胞外壳聚糖酶能力较高的假单胞菌(Pseudomonas sp .)。从荧光假单胞菌中分离纯化到单一组分的木聚糖酶。分离到1 株假单胞菌能分泌乙酰辅酶A 合成酶，利用二羧基脂肪酸合成乙酰辅酶A 。可见活跃在植物根际的这些假单胞菌酶系很丰富，并通过其产生的酶防治植物病害和加速植物对一些有机物的利用。

6)改善植物营养。微生物在土壤物质转化中具有非常重要作用，包括对一些难溶性无机物质的转化和分解有机质为植物提供养分。国内外学者已将一些假单胞菌研制成无机磷细菌肥料施于土壤，转化难溶性无机磷，并对优良菌株分离与有关功能机理进行了研究。

7)诱导系统抗性作用。一些根部定殖假单胞菌能诱导某些植物如黄瓜、烟草、拟南芥等对病毒、细菌和真菌叶部病原的系统抗性，其中水杨酸的积累被认为是引发植物抗病基因表达的重要因素，在P.aeruginosa中水杨酸生物合成的基因pchA 和pchB 已被克隆，各自编码邻-香豆酸合成酶和邻-香豆酸-丙酮酸裂解酶，均为pchDCB 操纵子的一部分，这2 种酶在离体状况或在原位均能催化邻-香豆酸转变为水杨酸。

另外脂多糖(Lipo-polysaccharide，Lps)和嗜铁素也是重要的诱导物质，其诱导系统抗性(Induced sy stemic resistance，ISR)的可能机制为产生抗微生物的低分子量化学物质，如植物保卫素、叶面的双萜积累、多聚物(可形成保护层)、木质素和富含羟脯氨酸的糖蛋白；诱导一些水解酶和氧化酶类，如几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和过氧化物酶；诱导病程相关蛋白的产生等。有报道表明先用荧光假单胞菌WSC417 处理康乃馨，然后再接种镰刀萎蔫病病原菌，则明显提高寄主植物植保素水平。

主要参考资料

[1] 五种假单胞菌的分离鉴定及其生物活性

[2] 郭亚辉, 郭坚华, 李斌. 根据 16S rRNA 序列对假单胞菌属分类学的研究进展[J]. 微生物学杂志, 2004, 24(2): 38-41.

[3] 临床常用药物

[4] 杨海君, 谭周进, 肖启明, 等. 假单胞菌的生物防治作用研究[J]. 中国生态农业学报, 2004, 12(3): 158-161.