WI-38人胚肺细胞的应用

背景^[1-3]

WI-38人胚肺细胞是来自妊娠3个月的正常胚胎肺组织。WI-38细胞是首株用于人类疫苗制备的人二倍体细胞系，培养液中添加TNF-α可以促进WI-38细胞生长。

WI-38人胚肺细胞

细胞培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于Cryptococcus heimaeyensis S20胞外多糖CHEPS诱导非小细胞肺癌细胞死亡及分子机制研究

CHEPS能够有效抑制NSCLC细胞活性,而对正常的人胚肺成纤维细胞WI-38和MRC-5的抑制效果较弱。进一步的研究发现,CHEPS通过上调周期调控蛋白p53和p21的表达以及下调Cyclin B1、CDK1、Cyclin A2和CDK2的表达,有效诱导了NSCLC细胞的S和G2/M期停留。而CHEPS在WI-38细胞中诱导的S和G2/M期停留效果不如在NSCLC细胞中明显。

此外,CHEPS不通过细胞凋亡通路来诱导细胞死亡,表现为不能诱导细胞磷脂酰丝氨酸外翻和凋亡标志蛋白Bax的上调以及Caspase 3、PARP等蛋白的剪切。通过EGFP-LC3荧光点聚集实验、LC3转换和周转实验、电镜实验以及对自噬相关基因的m RNA和蛋白水平的检测,我们证实CHEPS可以诱导NSCLC和WI-38细胞自噬潮的发生。

细胞自噬早期抑制剂3-MA处理和通过sh RNA干扰自噬基因ATG5的蛋白表达均能部分拯救CHEPS诱导的NSCLC细胞死亡,而3-MA却不能有效回复CHEPS诱导的WI-38细胞的死亡。这些结果表明CHEPS诱导了NSCLC细胞自噬性细胞死亡。虽然CHEPS诱导了WI-38细胞自噬,但自噬并不导致WI-38细胞死亡。

PI3K/AKT、AMPK、MAPK是三个调控细胞自噬的重要信号。我们的实验发现,CHEPS不能抑制AKT的磷酸化激活,说明CHEPS不通过PI3K/AKT信号通路诱导自噬发生。CHEPS激活了AMPK信号,但激活的AMPK并不能激发NSCLC细胞自噬和死亡。CHEPS诱导了MAPK通路中的p38、ERK、JNK磷酸化激活,其中p38和ERK有效促进了CHEPS诱导的NSCLC细胞死亡,抑制p38和ERK后部分拯救了CHEPS诱导的NSCLC细胞死亡。

CHEPS不能有效激活WI-38细胞中的MAPK信号通路。进一步的实验证明,ERK的磷酸化激活促进了CHEPS诱导的S和G2/M期停留。p38和ERK均能促进CHEPS诱导的NSCLC细胞自噬,它们的抑制剂和RNA干扰实验部分下调了CHEPS诱导的LC3-II蛋白的表达。

诱导活性氧（ROS）的积累是一些化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的重要分子机制。CHEPS处理可导致NSCLC细胞内ROS的产生,ROS的清除剂NAC能部分抑制CHEPS诱导的NSCLC细胞中p38和ERK的磷酸化水平、细胞自噬和细胞死亡,说明ROS的积累促进了p38和ERK调控的自噬性细胞死亡。ROS对CHEPS诱导的NSCLC细胞中S和G2/M期停留没有影响。

CHEPS不能诱导WI-38细胞中ROS的积累。除了体外细胞实验,我们还建立了裸鼠A549肺癌细胞异种移植瘤模型,以研究CHEPS在体内对肺癌细胞的影响。100mg/kg的CHEPS在动物体内能够有效抑制A549移植瘤的生长,同时并不造成裸鼠体重减轻和肝、脾、肺、肾等主要脏器的器官毒性。

与体外细胞实验结果一致,在动物体内,CHEPS也诱导了ROS的产生、激活了p38和ERK通路、激发了细胞自噬。我们的研究首次从体内外证明了隐球酵母Cryptococcus heimaeyensis S20胞外多糖CHEPS在非小细胞肺癌中的抗肿瘤活性,并且探讨了潜在的机制。CHEPS通过激活ROS/p38/ERK信号,有效诱导了NSCLC细胞中的S和G2/M期停留和自噬性细胞死亡。

参考文献

[1]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD,Jacques Ferlay ME,Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD,Rebecca L.Siegel MPH,Lindsey A.Torre MSPH,Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2018(6)

[2]The genus Cordyceps:An extensive review of its traditional uses,phytochemistry and pharmacology[J].Opeyemi Joshua Olatunji,Jian Tang,Adesola Tola,Florence Auberon,Omolara Oluwaniyi,Zhen Ouyang.Fitoterapia.2018

[3]Targeted Therapy and Immunotherapy in the Treatment of Non–Small Cell Lung Cancer[J].Girish S.Shroff,Patricia M.de Groot,Vassiliki A.Papadimitrakopoulou,Mylene T.Truong,Brett W.Carter.Radiologic Clinics of North America.2018(3)

[4]Staging of Non–Small-Cell Lung Cancer[J].Tim Akhurst.PET Clinics.2018(1)

[5]郝瑶.Cryptococcus heimaeyensis S20胞外多糖CHEPS诱导非小细胞肺癌细胞死亡及分子机制研究[D].武汉大学,2019.