人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(TP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(TP)ELISA试剂盒是通过双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法定量测定血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中的含量。

实验原理：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品中胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(TP)的浓度。

人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(TP)ELISA试剂盒

样本处理

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于干扰素-α调节肾细胞癌TP，TS和VEGF表达对5-FU化疗效果影响的研究

采用RT-PCR，免疫组化和MTT等方法观察人肾细胞癌中TP，TS的表达水平与临床病理因素和5-FU的敏感性之间的联系，然后利用RT-PCR，免疫组化，Western-blot，流式细胞仪和TUNEL检测体内和体外环境下干扰素-α对肾细胞癌中TP，TS和VEGF表达的调控作用，以及这种调控对肾细胞癌凋亡水平和5-FU化疗敏感性的影响，来评估TP，TS和VEGF表达变化在干扰素-α联合5-FU化疗协同作用中的地位，以期为临床肿瘤个体化治疗方案的制定提供参考指标。

1. 肾细胞癌中TP，TS表达与临床病理特征及药敏关系的研究方法1．半定量RT-PCR的方法对43例肾细胞癌患者的肿瘤标本和7例正常肾组织标本进行TP和TS mRNA相对表达量检测。

2. 应用免疫组化技术对上述标本进行TP，TS和CD34蛋白表达的检测。

3. 利用图文分析系统分析上述标本中以CD34反映的微血管密度和TP蛋白表达的相关性。

4. 应用原代细胞培养技术分离培养26例肾细胞癌标本中的癌细胞，通过MTT法检测癌细胞对5-FU的敏感性，并与TP，TS mRNA和蛋白表达结果相结合，分析TP和TS表达与5-FU敏感性的相关联系。

5. 统计学处理应用SPSS 13.0统计软件包对所有资料进行统计学处理。采用了t检验、方差分析、相关性检验。以α=0.05为检验水准，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结果1．肾细胞癌组织和正常肾组织均有TP，TS mRNA表达且表达水平变化幅度较大。肾癌TP mRNA表达范围在0.31～0.88，平均0.7193±0.1282。TS mRNA表达范围在0.48～0.91，平均0.7400±0.0954。正常肾组织中，TP mRNA表达范围在0.24～0.43，平均0.3359±0.0714。TS mRNA表达范围在0.36～0.61，平均0.4917±0.0886。癌组织中TP，TS mRNA的表达量均明显高于正常肾组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2．肾癌组织中TP mRNA表达与肿瘤体积，分期，淋巴结转移和远处转移均无关（P＞0.05）。TS mRNA表达与肿瘤体积，淋巴结转移和远处转移无关（P＞0.05），但与肿瘤的分期有关（P＜0.05）。

3．TP和TS蛋白在43例肾细胞癌中均有表达。TP蛋白表达在细胞浆，高表达时表达在细胞核。TS蛋白仅表达在细胞浆。正常肾组织TP的阳性表达率在28.57％（2／7），TS的阳性表达率在57.14％（4／7）。正常组织中TP，TS均表达在肾小管上皮细胞胞浆。

4．TP蛋白的表达与肿瘤体积，分期和淋巴结转移无关（P＞0.05），但和远处转移有关（P＜0.05）。TS蛋白的表达与肿瘤体积，分期，淋巴结转移和远处转移均无关（P＞0.05）。

5．TP mRNA与TP蛋白表达无相关性（P＞0.05）。TS mRNA表达与TS蛋白表达组之间存在一定相关性（P＜0.05）。

参考文献

[1]Synergy of Interferon-αand 5-Fluorouracil in Human Renal Cell Carcinoma Requires p53 Activity[J].Donghao Shang,Noriyuki Ito,Jun Watanabe,Yasuo Awakura,Hiroyuki Nishiyama,Toshiyuki Kamoto,Osamu Ogawa.European Urology.2007(4)

[2]Oral Capecitabine（Xeloda）in Cancer Treatment[J].Diane P.Doyle,Constance Engelking.The Nurse Practitioner.2007(2)

[3]Thymidylate synthase,dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidine phosphorylase expression in colorectal cancer and normal mucosa in patients[J].Federica Amatori,Antonello Di Paolo,Mario Del Tacca,Gabriella Fontanini,Francesca Vannozzi,Laura Boldrini,Guido Bocci,Marianna Lastella,Romano Danesi.Pharmacogenetics and Genomics.2006(11)

[4]Squamous cell carcinoma of the lung compared with other histotypes shows higher messenger RNA and protein levels for thymidylate synthase[J].PaoloCeppi,MarcoVolante,SilviaSaviozzi,IdaRapa,SilviaNovello,AlbertoCambieri,MarcoLo Iacono,SusannaCappia,MauroPapotti,Giorgio V.Scagliotti.Cancer.2006(7)

[5]李琦.干扰素-α调节肾细胞癌TP，TS和VEGF表达对5-FU化疗效果影响的研究[D].郑州大学,2007.