人血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）检测样本中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的含量。

原理：往预先包被人血管内皮细胞生长因子（VEGF）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人血管内皮细胞生长因子（VEGF）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA试剂盒

操作步骤：

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3. 待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4. 随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于血管内皮细胞生长因子基因转染成纤维细胞的实验研究

（1）体外扩增人血管内皮细胞生长因子165基因全长序列并构建真核质粒表达载体；（2）用重组载体转染原代培养的人胎儿成纤维细胞，得到转基因细胞株；（3）对转基因细胞进行初步研究，探讨其直接应用于创面移植及用于复合人工皮的构建的可行性并为其提供原料。

（2）方法：（1）设计合成引物，抽提肝癌组织总RNA为模板，用RT-PCR方法体外扩增hVEGF165全长基因，并以穿梭质粒pcDNA3为骨架，构建真核表达载体pcDNA3-hVEGF165；

（3）用FeGENE6转染试剂转染原代培养的人胎儿成纤维细胞，通过G418进行筛选，得到单克隆细胞，继续培养扩增得到转基因细胞株；

（4）通过一系列实验对转基因细胞进行初步研究：①将转基因细胞消化收集，抽提总RNA，用RT-PCR方法检测转基因细胞VEGF基因的转录水平，并以正常细胞作对照；

②用ELISA方法检测转基因细胞培养上清液中VEGF表达的浓度和持续时间，评价外源基因翻译水平和表达蛋白的分泌状况；

③用转基因细胞培养上清液培养血管内皮细胞，通过测定血管内皮细胞细胞生长曲线的改变，来检测其表达蛋白的生物学活性；

④采用MTT方法对转基因细胞的细胞增殖曲线进行测定；

⑤Miles实验，通过检测培养上清液对血管通透性的影响，检测表达蛋白的生物学活性。

参考文献

[1]Quantitative measurement of the splice variants 120 and 164 of the angiogenic peptide vascular endothelial growth factor in the time flow of fracture healing:a study in the rat[J].Thomas Pufe,Britt Wildemann,Wolf Petersen,Rolf Mentlein,Michael Raschke,Gerhard Schmidmaier.Cell and Tissue Research.2002(3)

[2]Vascularized pedicle bone-grafting for nontraumatic avascular necrosis of the femoral head A 5-to 11-year follow-up[J].Y.Hasegawa,H.Iwata,S.Torii,T.Iwase,K.Kawamoto,S.Iwasada.Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery.1997(5)

[3]Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors[J].Noel Weidner.Breast Cancer Research and Treatment.1995(2)

[4]Effect of growth rate on stability and gene expression of a recombinant plasmid during continuous culture ofEscherichia coli in a non-selective medium[J].Nabil Nancib,Joseph Boudrant.Biotechnology Letters.1992(8)

[5]李刚.血管内皮细胞生长因子基因转染成纤维细胞的实验研究[D].第二军医大学,2002.