化学发光试剂盒的应用

背景^[1-3]

化学发光试剂盒是一种超敏ECL化学发光试剂盒，本产品与二抗上偶联的辣根过氧化物酶（HRP）发生化学反应发出萤光，从而可以通过用X光片压片或其它适当化学发光成像设备检测样品。

HRP（40 kDa）已成为化学发光蛋白质印迹检测的常规酶。其稳定性和较小的分子量使其应用逐渐普及，通过使每个IgG标记更多的分子，可实现更高的检测灵敏度。此外，HRP化学发光底物的改良和发展使其相较AP底物具有更高的蛋白质印迹检测灵敏度。

化学发光试剂盒

用于辣根过氧化物酶（HRP）的化学发光底物多为双组分系统，由稳定的过氧化物溶液和增强型鲁米诺溶液组成。如果要制备工作液，需要将两种组分混合在一起。当与结合有HRP标记抗体（或其他探针）的印迹一起孵育时，化学反应生成的发射光可在425nm下，通过X光胶片、CCD成像系统和用于检测化学发光的磷光成像仪进行采集。发射光仅在酶-底物反应期间发生；因此，一旦酶周围的底物耗尽，信号输出将停止。虽然X-光胶片能够提供定性和半定量的数据，并可以用来确认靶蛋白的存在，但冷CCD成像装置能够提供定性分析、即时图像处理，具有更高灵敏度、更高分辨率和比胶片更大的动态范围等优点。

应用^[4][5]

用于血清胸苷激酶单克隆抗体酶促化学发光试剂盒的研制

制特异性强、灵敏度高的检测S-TK1（血清胸苷激酶）的单克隆抗体酶促化学发光试剂盒,以用于肿瘤早期检测、预后和术后观察及临床疗效监控。

方法：制备一对抗S-TK1单克隆抗体。1抗体制备A.设计并合成长度为15个氨基酸的S-TK1多肽,并与载体蛋白KLH耦联制备多肽抗原；B.从Raji细胞提取物中纯化获得TK1抗原蛋白；C.抗S-TK1多肽抗原单克隆抗体的制备：常规免疫Balb/c小鼠,选择血清抗体滴度较高的小鼠,取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选获得7株高亲和力的抗S-TK1多肽的单克隆抗体,用于制备包被抗体；D.抗Raji细胞TK1抗原蛋白单克隆抗体的制备：方法如C,获得3株高亲和力的Raji细胞TK1抗原蛋白单克隆抗体,用于制备检测抗体。

2. 抗体鉴定通过对小鼠进行小规模的腹水生产,用蛋白质A亲合柱从每个腹水样本中分离纯化单克隆抗体,经ELISA.免疫印迹法鉴定单克隆抗体效价、特异性、亲和力以及种属交叉反应,最后用旋转瓶培养技术进行抗体生产。

3. 制作S-TK1酶促化学发光试剂盒1抗体配对将7株高亲和力的抗S-TK1多肽的单克隆抗体和3株高亲和力的Raji细胞TK1抗原蛋白单克隆抗体配对,用ELISA进行测试。标记抗体使用辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase,HRP）标记检测抗体。

化学发光法试剂盒工作参数的确定以鲁米诺、对-2甲苯酚、吐温-20为化学发光底物；经比较确定包被抗体和检测抗体的稀释度；包被抗体即用稀释的抗体加在酶标板上4℃温育过夜,之后洗涤,干燥过夜,用透明胶带封存。

参考文献

[1]Thymidine kinase 1 expression defines an activated G1 state of the cell cycle as revealed with site-specific antibodies and ArrayScan?assays[J].Fabio Gasparri,Naining Wang,Sven Skog,Arturo Galvani,Staffan Eriksson.European Journal of Cell Biology.2009(12)

[2]Concentration of thymidine kinase 1 in serum（S-TK1）is a more sensitiveproliferation marker in human solid tumors than its activity[J].Qimin He,Pinggn Zhang,Li Zou,Hongxun Li,Xiuqin Wang,Shan Zhou,Tommy Fornander,Sven Skog.Oncology Reports.2005(4)

[3]Production and characterisation of a novel chicken IgY antibody raised against C-terminal peptide from human thymidine kinase 1[J].Chuanjing Wu,Rongjiang Yang,Ji Zhou,Shing Bao,Li Zou,Pinggan Zhang,Yongrong Mao,Jianping Wu,Qimin He.Journal of Immunological Methods.2003(1)

[4]Thymidine kinase:diagnostic and prognostic potential[J].O’Neill,Buckwalter,Murray.Expert Review of Molecular Diagnostics.2001(4)

[5]赵群莉.血清胸苷激酶单克隆抗体酶促化学发光试剂盒的研制[D].天津医科大学,2013.