小鼠原B细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠原B细胞是指在脾及淋巴结等末梢淋巴系组织的淋巴细胞中的抗体形成细胞前体。与淋巴细胞另一类型的T细胞在组织内分布不同，而在形态上不易区别。B细胞应免疫原刺激而增殖，并向IgM抗体形成细胞的大淋巴细胞及其他种类抗体形成细胞的浆细胞方向分化。

小鼠原B细胞与淋巴细胞另一类型的T细胞在组织内分布不同，而在形态上不易区别。小鼠原B细胞株原是以骨髓（bone marrow）产生细胞的意义得名，但后来知道T细胞也是骨髓的细胞向胸腺转移到末梢淋巴系组织中来的，现在B细胞意味着不依赖胸腺的淋巴细胞。

B细胞在胞膜的表面具有与将来每个细胞可能产生的抗体相同的单一特异性的免疫球蛋白受体，因而保有与抗免疫球蛋白抗体相结合的特性。在鸟类，骨髓的干细胞迁移到腔上囊（bursa of Fabrici-us）而分化为B细胞，但在鸟类以外的动物，其与腔上囊相等的器官尚不清楚。B细胞应免疫原刺激而增殖，并向IgM抗体形成细胞的大淋巴细胞及其他种类抗体形成细胞的浆细胞方向分化。

小鼠原B细胞

传代流程：

1.吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1~2 ml 0.25%EDTA的胰酶消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）。

2.镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。

3.取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养。

4.注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。

应用^[4][5]

用于Apg-2过表达在BaF3-BCR/ABL细胞中的作用研究

通过在BaF3-BCR/ABL及BaF3-MIGR1细胞中过表达Apg-2,研究Apg-2过表达在BaF3-BCR/ABL细胞中的作用,旨在探讨Apg-2蛋白在BCR/ABL阳性的慢性粒细胞白血病（chronic myelogeneous leukemia,CML）的发生发展及临床治疗的应用前景。

方法：将Apg-2基因插入到质粒pIRES2-EGFP,通过酶切和测序鉴定重组表达质粒pIRES2-EGFP-Apg-2。用电穿孔转染法将该表达质粒转染BaF3-BCR/ABL细胞和BaF3-MIGR1对照细胞,经G418筛选稳定表达细胞株,分别用RT-PCR和western blot鉴定Apg-2的表达。FCM分析细胞周期和凋亡,Am-Blue检测细胞增殖,克隆形成实验观察细胞生长,western-blot检测Bcl-2和Bax蛋白表达。

H2O2处理后用Am-Blue检测细胞活力,并检测乳酸脱氢酶（LDH）释放率、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性,western-blot和免疫荧光检测H2O2损伤细胞后组蛋白H2AX丝氨酸139位点磷酸化（γ-H2AX）水平和焦点数。

结果（1）成功构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-Apg-2,转染和筛选出稳定表达Apg-2的BaF3-BCR/ABL细胞株（BaF3-BCR/ABL-Apg-2）和BaF3-MIGR1对照细胞株（BaF3-MIGR1-Apg-2）;

（2）Apg-2过表达能促进BaF3-BCR/ABL细胞周期进程,增加细胞增殖和克隆形成,抑制BaF3-MIGR1细胞周期进程,减少细胞增殖和克隆形成;而对其细胞凋亡无明显作用;

（3）Apg-2过表达明显明高H2O2损伤后BaF3-BCR/ABL细胞细活率,减少细胞细损伤,减少LDH释放,降降MDA含量,明高SOD活性,从而保保细胞免保H2O2诱导的细胞损伤,抑制γ-H2AX表达和焦点形成,减少BaF3-BCR/ABL细胞氧化应氧诱导的DNA损伤。

参考文献

[1]A Backup DNA Repair Pathway Moves to the Forefront[J].AndréNussenzweig,Michel C.Nussenzweig.Cell.2007(2)

[2]Effect of double-strand break DNA sequence on the PARP-1 NHEJ pathway[J].Marc Audebert,Bernard Salles,Patrick Calsou.Biochemical and Biophysical Research Communications.2007(3)

[3]Constitutive histone H2AX phosphorylation and ATM activation are strongly amplified during mitogenic stimulation of lymphocytes[J].T.Tanaka,M.Kajstura,H.D.Halicka,F.Traganos,Z.Darzynkiewicz.Cell Proliferation.2007(1)

[4]Heat Shock Proteins 27 and 70:Anti-Apoptotic Proteins with Tumorigenic Properties[J].Carmen Garrido,Mathilde Brunet,Celine Didelot,Yael Zermati,Elise Schmitt,Guido Kroemer.Cell Cycle.2006(22)

[5]李春莉.Apg-2过表达在BaF3-BCR/ABL细胞中的作用研究[D].重庆医科大学,2010.