小鼠多酚氧化酶(PPO)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠多酚氧化酶(PPO)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）检测样本中小鼠多酚氧化酶(PPO)的含量。

实验原理：将小鼠多酚氧化酶(PPO)抗体包被于96孔微孔板中,制成固相载体,向微孔中分别加入标准品或标本,其中的目标连接于固相载体上的抗体结合,然后加入微生物化的目标抗体,将未结合的生物素抗体洗净后,加入HRP标记和亲和素,再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值),计算样品浓度。

小鼠多酚氧化酶(PPO)

实验操作步骤：

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在*、第二孔中分别加标准品100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1200ng/L，800ng/L，400ng/L，200ng/L，100ng/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于多酚氧化酶催化鸡蛋卵白蛋白交联对其结构与功能性质的影响研究

采用不同温度、时间的加热方式,添加化学试剂的方法使OVA变性;利用双孢蘑菇多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）对变性的OVA进行催化交联。

通过SDS-PAGE电泳及紫外分光光谱法对交联条件进行筛选,寻找的交联反应条件;利用光谱学方法表征OVA样品的结构;采用SDS-PAGE方法评估不同OVA样品的体外模拟胃肠消化性;利用竞争ELISA和人外周血嗜碱性粒细胞KU812体外细胞模型,评估OVA致敏性的变化;并对交联前后OVA的加工功能特性分析评定。

方法：利用SDS-PAGE电泳和紫外光谱,确定了OVA变性辅助交联的条件:1.0 mg/m L的OVA样品100μL,pH 7.0条件下,两种变性处理参数分别为:热变性为100℃水浴加热5min;化学变性为加入0.5%SDS于50℃水浴1 h;不同变性处理后的OVA样品分别加入PPO,使体系中酶活为1000 U/m L,50℃恒温水浴锅交联8 h。OVA样品共6组:天然OVA（N-OVA）,100℃-5min热处理OVA（H-OVA）,0.5%SDS变性OVA（SDS-OVA）;天然OVA交联产物（CL-OVA）,100℃-5min热处理辅助PPO催化OVA交联产物（CL-H-OVA）,0.5%SDS变性辅助PPO催化OVA交联产物（CL-SDS-OVA）。

参考文献

[1]Cross-linked ovalbumin catalyzed by polyphenol oxidase:Preparation,structure and potential allergenicity[J].Ke Liu,Shuguang Chen,Hongbing Chen,Ping Tong,Jinyan Gao.International Journal of Biological Macromolecule.2018

[2]Caffeic acid-assisted cross-linking catalyzed by polyphenol oxidase decreases the allergenicity of ovalbumin in a Balb/c mouse model[J].Ping Tong,Shuguang Chen,Jinyan Gao,Xin Li,Zhihua Wu,Anshu Yang,Juanli Yuan,Hongbing Chen.Food and Chemical Toxicology.2018

[3]Emulsifying properties of ovalbumin:Improvement and mechanism by phosphorylation in the presence of sodium tripolyphosphate[J].Zhouyi Xiong,Maojie Zhang,Meihu Ma.Food Hydrocolloids.2016

[4]Peanut protein structure,polyphenol content and immune response to peanut proteins in vivo are modulated by laccase.[J].Mihajlovic L,Radosavljevic J,Nordlund E,Krstic M,Bohn T,Smit J,Buchert J,Cirkovic Velickovic T.Food&function.2016(5)

[5]刘珂.多酚氧化酶催化鸡蛋卵白蛋白交联对其结构与功能性质的影响[D].南昌大学,2018.