多酚氧化酶(PPO)试剂盒的应用

背景^[1-3]

多酚氧化酶(PPO)试剂盒是利用PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在410nm有特征光吸收的特性检测样本中PPO的含量。PPO主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

在植物（如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等）组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。

多酚氧化酶(PPO)

在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO，含量大约与蛋白质部分相同；在茶叶中的PPO分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态，新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。

多酚氧化酶是一种质体酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中，缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有多酚氧化酶，如C4植物叶。含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中。

应用^[4][5]

用于苹果膜结合态多酚氧化酶分离纯化及性质研究

苹果中膜结合态多酚氧化酶约占总PPO的85%,且在某些因素激发下表现出高催化活性,但对其的研究近乎空白。本文比较了红富士、黄元帅、澳洲青苹的膜结合态多酚氧化酶（mPPO）性质,建立了富士苹果mPPO的分离纯化方法,研究了mPPO的酶学特性和生物学信息,探索mPPO三维结构和活性中心结构,并研究不同底物条件下,抑制剂处理对mPPO活性、紫外吸收光谱及荧光发射光谱的影响。

主要研究结果如下：（1）红富士、黄元帅、澳洲青苹三者mPPO性质差异显著。红富士mPPO在pH8.00时酶活最高,黄元帅mPPO最适pH为4.50,而澳洲青苹mPPO则在pH7.50～8.00内活性最高。红富士mPPO最适反应温度为55℃,黄元帅mPPO在35-55℃内活性较高且无显著差异,澳洲青苹mPPO在70～75℃内活性最高,且黄元帅mPPO在高温区间热稳定性高于红富士和澳洲青苹mPPO。以邻苯二酚为底物时,澳洲青苹的mPPO对底物亲和力最强,但红富士mPPO催化速率。黄元帅与红富士mPPO粗提液有相似酶带,澳洲青苹酶带最少。

（2）富士nPPO分离纯化条件为：超声提取10min,50%-80%饱和度硫酸铵沉淀,0.1MNaCl梯度洗脱。纯化后,mPPO纯度提高64.30倍,比活力达387032.97U.mg-1,经SDS-PAGE和Native-PAGE分析均为单一蛋白带,经串联质谱分析及蛋白数据库鉴定为多酚氧化酶。

（3）富士中mPPO与可溶态多酚氧化酶（sPPO）性质差异明显。mPPO活性是sPPO活性的34.12倍。mPPO及sPPO最适作用底物分别为4-甲基儿茶酚和邻苯二酚。mPPO及sPPO的最适反应pH值分别为8.00和4.50,最适反应温度分别为65和45℃。mPPO比sPPO更耐酸碱环境的变化,而mPPO比sPPO更耐高温。L-半胱氨酸对mPPO的抑制作用最强,但EDTA在一定浓度时对mPPO具有激活作用。

参考文献

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[5]刘芳.苹果膜结合态多酚氧化酶分离纯化及性质研究[D].中国农业大学,2015.