人胶原凝集素(COLLECTIN)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人胶原凝集素(COLLECTIN)ELISA KIT运用酶联免疫法可以检测不同样本中胶原凝集素(COLLECTIN)的含量。

实验原理:

用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

人胶原凝集素(COLLECTIN)ELISA KIT

实验步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用前一小时内配制)，酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。

4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

用于草鱼（Ctenopharyngodon idella）胶原凝集素（collectin）和转铁蛋白（transferrin）功能的初步分析研究

从已构建的草鱼（Ctenopharyngodon idella）肝肾cDNA文库中筛选到1个克隆,经测序和特征分析确定为草鱼胶原凝集素基因（GQ141696）。草鱼胶原凝集素全长cDNA为1128 bp,其中5’非编码区229 bp,3’非翻译区104 bp,开放阅读框为795 bp,编码1个264 aa组成的蛋白质。

系统进化分析表明草鱼胶原凝集素与斑马鱼的亲缘关系最近。根据草鱼胶原凝集素序列特征,克隆了包含糖基识别域（CRD）的cDNA,并进行原核表达、纯化获得其重组蛋白PCRD.进行PCRD与6种细菌的凝集和糖抑制实验,结果表明半乳糖、葡萄糖、甘露糖和麦芽糖4种糖都会使PCRD与嗜水气单胞菌的凝集明显下降甚至极大地干扰凝集。

麦芽糖使金黄色葡萄球菌的凝集明显下降,而肽聚糖和甘露糖会使凝集受到抑制。此外,PCRD的凝集反应不依赖Ca2+。转铁蛋白（transferrin,Tf）是一种非血红素结合铁的β-球蛋白,其N-端和C-端的2个同源结构域由一个短铰链区链接,草鱼转铁蛋白每个结构域含有4个铁离子结合位点,分别结合4个Fe3+。转铁蛋白功能广泛,不仅参与机体铁离子的运输和代谢,还在细胞呼吸、细胞生长和增殖中起重要作用,而且它具有抗菌杀菌功能,与机体的先天性免疫有关。

为了解鱼类转铁蛋白与铁离子结合的分子机理以及N-端和C-端的2个同源结构域的功能,本文根据实验室前期克隆的草鱼转铁蛋白基因（EU790874）全长cDNA序列特征,分别克隆了包含这2个结构域的cDNA,并进行原核表达、纯化获得其重组蛋白PTf1、PTf2.进行重组蛋白结合铁离子能力检测。

参考文献

[1]Innate immune gene expression in individual zebrafish after Listonella anguillarum inoculation[J].Irune Rojo,óskar Martínez de Ilárduya,Andone Estonba,Miguelángel Pardo.Fish and Shellfish Immunology.2007(6)

[2]Identification of immune genes in grass carp Ctenopharyngodon idella in response to infection of the parasitic copepod Sinergasilus major[J].M.X.Chang,P.Nie,G.Y.Liu,Y.Song,Q.Gao.Parasitology Research.2005(4)

[3]Oligomerisation and carbohydrate binding in an Atlantic salmon serum C-type lectin consistent with non-self recognition[J].Linda Stratton,Shane Wu,Robert C Richards,K Vanya Ewart.Fish and Shellfish Immunology.2004(4)

[4]Differential effects of apotransferrin on two populations of oligodendroglial cells[J].C.I.García,P.Paez,E.F.Soto,J.M.Pasquini.Glia.2003(4)

[5]李琴.草鱼（Ctenopharyngodon idella）胶原凝集素（collectin）和转铁蛋白（transferrin）功能的初步分析[D].南昌大学,2010.