人脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养试剂盒的应用

背景^[1-3]

人脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养试剂盒可用于人类骨髓、脐带、脂肪等组织来源的间充质干细胞的成骨诱导分化与染色，兼容诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、蛋白表达检测、免疫组化检测等。

人脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养试剂盒包括间充质干细胞成骨分化基础培养基、人脐带间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒和茜素红染色液。

人脂肪间充质干细胞

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是中胚层来源的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多项分化潜能，体外在一定的条件下可以被诱导分化成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。

hMSC能够分化为成骨细胞，沉积并矿化胞外基质蛋白，这是新生骨骼所必需的。分化成骨后会矿化形成钙结节且有钙分泌，可以利用茜素红S(Alizarin Red S)染色检视分化的成骨细胞。不同的细胞来源（类型、年龄、代数）所得到的分化效果会有差异。

使用说明：

1、配液前30 min左右，人脐带间充质干细胞成骨分化试剂盒中试剂A、试剂B、试剂C和试剂D预先放置室温溶解，可短暂离心（2000g），以确保试剂能全部收集。

2、于超净台内无菌环境打开间充质干细胞成骨分化基础培养基和四种试剂的瓶/管盖。

3、将试剂A、试剂B、试剂C和试剂D全部加入间充质干细胞成骨分化基础培养基中。可吸取少量基础培养基洗涤各试剂管，以确保四种试剂完全加入。

4、充分混匀后即可使用。

应用^[4][5]

用于Choukroun’s PRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化影响的实验研究

体外培养人脂肪干细胞（ADSCs）后,给予自体富血小板纤维蛋白（Choukroun’s PRF）干预,并与对照组进行对比,观察自体富血小板纤维蛋白（Choukroun’s PRF）对人脂肪干细胞（ADSCs）增殖及成骨分化能力的影响,探讨一种可能增强脂肪干细胞增殖及成骨分化的技术,为骨组织工程的种子细胞提供一种新的技术和思路。

方法：1.实验组织来源：所用脂肪来自于成人腹部脂肪抽脂术和骨科大腿手术获得的脂肪组织,供体共8位,为20～40岁患者,为2位珠江医院整形外科和6位骨科的就诊患者,无传染病及内分泌疾病,无长期服用药物史。静脉血来自相应脂肪来源的对应患者。

2. 体外培养人脂肪干细胞,实验所用的细胞为第3代细胞。

3. 人脂肪干细胞的鉴定：分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定,并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。

4. 采用Choukroun法制备富血小板纤维蛋白（PRF）。

5. 实验分组：本实验将普通细胞培养基中加入PRF与否,分为PRF组Ⅰ和对照组Ⅰ,并选择4个时间点（1d、3d、5d、7d）分别对比观察两组细胞增殖情况；成骨诱导培养基中加入PRF与否,分为PRF组Ⅱ和对照组Ⅱ,同样选择4个时间点（7d、14d、21d、28d）,对比观察各时间点脂肪干细胞成骨诱导情况,并以不含PRF的普通细胞培养基组作为空白对照。每组样本量3-4例。

6. CCK-8比色法制作标准曲线,检验测得的OD值与人脂肪干细胞数量之间的相关性。

7. CCK-8试剂盒测定PRF对ADSCs体外增殖的影响。

8. 检测碱性磷酸酶活性（ALP活性）判断两组脂肪干细胞成骨诱导水平。

9.Von Kossa染色法观察成骨诱导各组中细胞钙结节形成情况。

参考文献

[1]Enhancement of bone regeneration by gene delivery of BMP2/Runx2 bicistronic vector into adipose-derived stromal cells[J].Suk-Jun Lee,Sun-Woong Kang,Hyun-Jin Do,Inbo Han,Dong Ah Shin,Jae-Hwan Kim,Soo-Hong Lee.Biomaterials.2010(21)

[2]Restoration of peri-implant defects in immediate implant installations by Choukroun platelet-rich fibrin and silk fibroin powder combination graft[J].Eun-Sik Jang,Jun-Woo Park,HaeYong Kweon,Kwang-Gill Lee,Seok-Woo Kang,Dong-Heon Baek,Je-Yong Choi,Seong-Gon Kim.Oral Surgery,Oral Medicine,Oral Pathology,Oral Radiology and Endodontology.2010(6)

[3]Choukroun’s platelet-rich fibrin（PRF）stimulates in vitro proliferation and differentiation of human oral bone mesenchymal stem cell in a dose-dependent way[J].David M.Dohan Ehrenfest,Pierre Doglioli,Giuseppe M.de Peppo,Marco Del Corso,Jean-Baptiste Charrier.Archives of Oral Biology.2010(3)

[4]Icariin-mediated differentiation of mouse adipose-derived stem cells into cardiomyocytes[J].Ming-shun Jin,Sa Shi,Yi Zhang,Yan Yan,Xiao-dong Sun,Wei Liu,Hui-wen Liu.Molecular and Cellular Biochemistry.2010(1)

[5]刘元媛.Choukroun's PRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化影响的实验研究[D].南方医科大学,2013.