皮肤成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

皮肤成纤维细胞是分离自皮肤的成纤维细胞，成纤维细胞(人皮肤成纤维细胞)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。

成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。

皮肤成纤维细胞

成纤维细胞(人皮肤成纤维细胞)摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（prealpha polypeptide chain），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen）。前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。

应用^[4][5]

用于不同浓度过氧化氢致大鼠皮肤成纤维细胞衰老作用的研究

将SD大鼠的乳鼠尾尖剪碎,使用组织团块法获得皮肤成纤维细胞并传至三代,应用免疫荧光法鉴定分离培养的大鼠皮肤成纤维细胞。使用细胞培养液配制不同浓度的H2O2持续刺激三代皮肤成纤维细胞,根据细胞衰老β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）和CCK-8结果筛选出的H2O2浓度,将成纤维细胞分为4组:0μM、50μM、100μM和500μM。用4种浓度H2O2分别刺激成纤维细胞12h,每4h更换一次处理液,并在0h、4h、8h和12h四个时间检测相应指标。

用活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）试剂盒检测细胞内氧化-抗氧化情况;采用Western blot检测成纤维细胞内p16、p21、p53、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGFβ1）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT enhancer binding protein,C/EBPβ）和γH2A.X的表达水平;细胞计数法和流式细胞技术检测细胞增殖和细胞周期;使用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测衰老相关分泌表型典型因子白细胞介素-1α（Interleukin-1α,IL-1α）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）的分泌情况;最后采用免疫荧光法测定成纤维细胞DNA损伤指示蛋白γH2A.X。

成纤维细胞的形态学观察和免疫荧光结果确定成功分离培养原代大鼠皮肤成纤维细胞。0μM组的各项指标在各个时间点基本稳定,细胞形态良好,γH2A.X不表达。与0μM组相比,50μM组的ROS水平、CAT和SOD活力在12h内持续上升;p16、p21、p53表达量在0h-8h基本平稳,在12h有所升高;TGFβ1、C/EBPβ持续升高,G2+S期细胞比例不断增加,细胞数量稳定增加;IL-1α分泌量、IL-6和IL-8的分泌量在0h-8h基本稳定,12h显著增加;γH2A.X在12h开始表达。

100μM组的ROS水平不断升高,CAT和SOD活力在0h-4h上升,4h-12h持续下降;p16、p21、p53表达量持续升高;TGFβ1的表达量在0h-8h升高,8h-12h降低,C/EBPβ表达量在0h-8h迅速升高并稳定在较高水平,G2+S期细胞比例先增大后减小,细胞数量先增加后保持不变;IL-1α、IL-6和IL-8的分泌量不断上升,在12h显著高于50μM组;γH2A.X在8h开始少量表达,细胞核不断增大。

参考文献

[1]Oxidative stress in the aging substantia nigra and the etiology of Parkinson’s disease.[J].Trist Benjamin G,Hare Dominic J,Double Kay L.Aging cell.2019(6)

[2]The free radical theory of frailty:Mechanisms and opportunities for interventions to promote successful aging[J].Jose Vi?a.Free Radical Biology and Medicine.2019

[3]Co-operation of ABT-199 and gemcitabine in impeding DNA damage repair and inducing cell apoptosis for synergistic therapy of T-cell acute lymphoblastic leukemia.[J].Xiufeng Zhu,Haijun Zhao,Silei Bi,Manman Deng,Yong Zhou,Lian Yu,Zhihong Fang,Bing Xu.Anti-cancer drugs.2019(2)

[4]A Tale of Two Concepts:Harmonizing the Free Radical and Antagonistic Pleiotropy Theories of Aging.[J].Golubev Alexey,Hanson Andrew D,Gladyshev Vadim N.Antioxidants&redox signaling.2018(10)

[5]胡澜.不同浓度过氧化氢致大鼠皮肤成纤维细胞衰老作用的研究[D].东北农业大学,2020.