U14细胞的应用

背景^[1-3]

U14细胞是将U14瘤株腹腔接种于615小鼠，利用腹水进行原代培养，建立的U14细胞系。615小鼠、C57BL/6小鼠移植成瘤率均为100%。

U14细胞

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

应用^[4][5]

用于青蒿琥酯对宫颈癌U14细胞移植瘤VEGF及COX-2表达的影响研究

通过研究青蒿琥酯作用下宫颈癌U14移植瘤VEGF及COX-2的表达变化及其与微血管密度（MVD）的相关性,探究青蒿琥酯是否可通过抑制血管生成而发挥抗肿瘤效应。

方法:1移植瘤动物模型的建立及实验分组收集对数生长期U14细胞,调整浓度为1×107/ml,接种于小鼠腹腔（0.7ml/只）,待3-5天后腹水形成,取腹水离心后,生理盐水稀释为5×107/ml,于雌性KM小鼠（5-6周龄,15-17g）左后肢近背部皮下接种0.2ml。成瘤且肿瘤直径>5mm进行后续实验。

将实验动物随机分为4组:1、正常对照组（未接种肿瘤,肌注生理盐水1/日2、肿瘤对照组（成瘤后,肌注生理盐水1/日）;3、ART组（成瘤后,肌注青蒿琥酯20mg/kg/d）;4、DDP组（成瘤后,腹腔注射顺铂2mg/kg/d）,各给药0.2ml。每组80只,各组共给药7日。后各组再次随机分为4组,分别于第10d、20d、30d、40d处死,每组20只。

2肿瘤组织中VEGF及COX-2表达情况及MVD计数的分析制备肿瘤组织石蜡切片,免疫组化染色后进行图像分析,VEGF、COX-2表达强度以灰度值（GS）表示,数值大小与阳性细胞表达强度呈反比。以矩形走形计算200个细胞,计算各组阳性细胞表达百分率。光镜下VEGF染色阳性细胞呈棕黄色,采用weidner等方法进行MVD量化分析。

在低倍视野下扫视整个组织切片,在肿瘤浸润区域选取内皮细胞染色分析、微血管数量密集的视野,随机选取6个高倍视野,对微血管数计算,计算平均值作为MVD。任何棕黄色阳性内皮细胞或内皮细胞簇,只要与临近肿瘤细胞、血管及其他结缔组织分界清楚,即可作为1个微血管数;肿瘤硬化取和大于8个红细胞的血管不做计数对象。

参考文献

[1]Quantitative structureactivity relationship and molecular docking of artemisinin derivatives to vascular endothelial growth factor receptor 1.Saeed ME,Kadioglu O,Seo EJ,et al.Anticancer Research.2015

[2]Evidence for the involvement of carbon-centered radicals in the induction of apoptotic cell death by artemisinin compounds.Mercer Amy E,Maggs James L,Sun Xiao-Ming,Cohen Gerald M,Chadwick James,O’Neill Paul M,Park B Kevin.Journal of Biological Chemistry.2007

[3]Anti-tumor effects of dihydroartemisinin on human osteosarcoma.Ji Ye,Zhang Yi-Cai,Pei Liu-Bao,Shi Li-Li,Yan Jing-Long,Ma Xue-Hua.Molecular and Cellular Biochemistry.2011

[4]Artemisinin（qinghaosu）:the role of intracellular hemin in its mechanism of antimalarial action.Steven R.Meshnick,Abraham Thomas,Allen Ranz,Cai-Min Xu,Hua-Zhen Pan.Molecular and Biochemical Parasitology.1991

[5]王朝希.青蒿琥酯对宫颈癌U14细胞移植瘤VEGF及COX-2表达的影响[D].河北医科大学,2016.