γ-氨基丁酸的制备方法

背景及概述^[1]

γ-氨基丁酸，是一种白色或微黄色结晶状粉末，吸湿性强，极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于苯、冷乙醇、乙醚等有机溶剂，微臭，无旋光性，为极性物质，熔点为 203-205℃，相对分子质量为 103.12，分子式为 CHNO，γ-氨基丁酸的解离常数：pK= 4.03，pK= 10.56。γ-氨基丁酸在水溶液中通常以两性离子形式存在，其解离情况主要取决于pH值的大小，等电点为 7.295。γ-氨基丁酸是一种非蛋白质氨基酸，具有氨基酸的某些特殊化学性质，能发生烃基化反应、酰基化反应、茚三酮显色反应等。

制备方法^[1-2]

报道一、

（1）原料预处理过程：将茶叶作为原料进行清洗除杂脱酚，杀青烘干后粉碎备用；将鲜叶清洗并晾晒至含水量约 80%，分别将鲜叶在-18℃条件下处理16 h，然后用微波炉杀青 2-3 min（使用中高档，每 30 s 翻匀一次），然后放入鼓风干燥箱中在 80 ℃下烘至绝干，粉碎过 80 目筛。或者将鲜叶清洗并晾晒至含水量约 80%，分别将鲜叶在-18℃条件下处理16 h，然后用微波炉杀青 2-3 min（使用中高档，每 30 s 翻匀一次），然后放入鼓风干燥箱中在 80 ℃下烘至绝干，粉碎过 80 目筛。

（2）γ-氨基丁酸浸提过程：低频超声辅助碱提，制得γ-氨基丁酸提取液，具体过程为：称取一定量茶粉置于锥形瓶中，按照液料比20:1 mL/g 加入一定量超纯水后摇匀，在温度为 50 ℃，功率为 220 W 条件下超声浸提 30 min 冷却后离心，抽滤，得到γ-氨基丁酸粗提液；

（3）γ-氨基丁酸浓缩过程：用旋转蒸发仪将γ-氨基丁酸粗提液浓缩，加水配制成所需样品液浓度。采用真空浓缩或者旋转蒸发浓缩，真空浓缩温度控制在40-60℃，浓缩至原体积的20-50%。旋转蒸发浓缩时间为2h

（4）γ-氨基丁酸浓缩液的分离纯化过程：可采用静态吸附或者动态洗脱进行分离纯化；中静态吸附具体为：一定体积的树脂，加入 95%乙醇浸泡 24 h，用水洗至无絮状物且无乙醇味；然后用 4% NaOH 浸泡 5 h，用水洗至中性，再用 5% HCl 浸泡 8 h，用水洗至中性；动态吸附洗脱过程为：上样流速 3mL/min，上样浓度 0.2 mg/mL，洗脱液 pH=9，洗脱流速 2 mL/min。在此条件下，γ-氨基丁酸 的保留率为 80.06%，γ-氨基丁酸 的纯度达到78.51%。

（5）γ-氨基丁酸干燥和保存的过程；向上述所得的γ-氨基丁酸沉淀中加入20～60倍沉淀重量的纯净水，室温下洗涤6～8次，5000-11000r/min离心分离30min，得γ-氨基丁酸，加入5～15倍重量的纯净水，经搅拌调节pH至中性，再过胶体磨和均质机，喷雾干燥或冷冻干燥得γ-氨基丁酸产品。

通过此法得到的γ-氨基丁酸不仅纯度高，原始营养物质也保存较为完整，适合大面积推广。

报道二、

一、菌体培养

乳酸菌菌种经活化后，进行一级种子培养，二级种子培养，最后进入发酵罐培养，接种量3%（V/V，种子液/发酵液）， 30℃静置培养16 h，发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，通过0.6μm陶瓷膜过滤收集菌体。

种子培养基原料以g/L计：葡萄糖10，酵母膏 5，蛋白胨5，乙酸钠0.5，磷酸氢二钠（或磷酸氢二钾）1，硫酸镁1，硫酸锰1，PPE聚醚消泡剂0.1（但不仅限于此消泡剂，可选用任何可用于发酵工业的消泡剂）。

发酵培养基配方以g/L计：葡萄糖10，酵母膏 5，蛋白胨5，乙酸钠0.5，谷氨酸钠1，磷酸氢二钠（或磷酸氢二钾）1，硫酸镁1，硫酸锰1，PPE聚醚消泡剂0.1（但不仅限于此消泡剂，可选用任何可用于发酵工业的消泡剂）。

二、生产γ-氨基丁酸

采用乳酸菌细胞转化法生产γ-氨基丁酸，反应条件为：配制0.01mol/L pH7的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入20g/L菌体细胞，分批加入底物谷氨酸钠，初始底物浓度10g/L，每4h添加一次底物，添加浓度为5g/L，总反应底物浓度为25g/L，反应温度为28℃，发酵时间为17h。结束后，通过离心收集清液，得到含量达12g/L的γ-氨基丁酸转化液，见图1。

三、 γ-氨基丁酸含量的检测

将上述转化液离心后加入等体积100g/L的三氯乙酸，振荡均匀，再离心（10,000×g，5 min），清液稀释2-10倍，再经0.45 μm膜过滤，进行高效液相分析。采用ODS C18（φ4.6×250nm），40℃分析，γ-氨基丁酸用外标法定量。

四、产品制备：

过滤除菌：将得到的γ-氨基丁酸转化液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；

脱色：将过滤除菌后得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；

电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；

将步骤（4）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品。

所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：

（a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥50g/L时，停止浓缩；

（b）喷雾干燥：浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品；

所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：

（a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；

（b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品。

所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到纯度达到98%的γ-氨基丁酸晶体产品。

参考文献

[1] [中国发明] CN201811219488.1 一种茶叶中γ-氨基丁酸提取纯化工艺

[2] [中国发明,中国发明授权] CN201210304596.5 生物法制备γ-氨基丁酸的方法