细胞核提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

细胞核提取试剂盒提供了一种简单、方便的从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的细胞核的方法，适合于动物肝和脑组织、肌肉、以及培养细胞的细胞核的制备，可用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等研究。

细胞核提取试剂盒

样本处理：

组织：称取100-200 mg新鲜组织，使用生理盐水或PBS冲洗2-3次，滤纸吸干水分，将组织剪为碎块放入微量玻璃匀浆器中，加入1.0 mL Lysis Buffer（冰上预冷）和50μL Reagent A，冰浴研磨20-30次，即为组织匀浆液。（注：若有未研开组织，可用双层纱布进行过滤）

培养细胞：消化细胞后使用PBS洗涤，600 g离心10 min收集细胞5×107个细胞，加入1.0 mL Lysis Buffer（冰上预冷）重悬细胞，再加入50μL Reagent A，将细胞悬液转移至微量玻璃匀浆器中，冰浴研磨20-30次，即为细胞匀浆液；

提取过程：

①将组织/细胞匀浆液转移至离心管中，4℃700 g离心5 min，弃上清，留沉淀，沉淀中加入0.5 mL Lysis Buffer（冰上预冷），即为细胞核重悬液；

②取另一离心管中加入0.5 mL Medium Buffer，将细胞核重悬液加至Medium Buffer之上（沿管壁缓慢加入离心管中），4℃700 g离心5 min，弃上清，留沉淀，沉淀中加入0.5 mL Lysis Buffer重悬细胞核沉淀，4℃1000 g离心10 min，弃上清，留沉淀，即为纯化后的细胞核沉淀；

③使用50-100μL Store Buffer重悬细胞核沉淀，置于-80℃保存。

应用^[4][5]

用于枇杷DNA纤维制备及Fiber-FISH技术体系的建立与应用研究

进行了枇杷DNA纤维制备技术的摸索,包括细胞核提取方法、试验材料的选取与DNA纤维伸展等技术要点。对“刀切法”与“液氮研磨法”进行细胞核提取的效果进行了比较,并对枇杷不同发育时期的黄化子叶为试验材料进行细胞核提取的效果进行了比较。

采用“刀切法”相对于“液氮研磨法”进行细胞核提取效果较好,前者简便无毒,细胞核完整、无破损,且提取率为100%,后者操作复杂、有毒,且杂质多,细胞核易破损不完整,得率相对较低。

通过“刀切法”进行不同发育时间的黄化子叶提取细胞核的效果比较发现,发育4d的黄化子叶提取的细胞核含有杂质,提取效果不好；发育10d的黄化子叶由于趋于老化且可能腐烂,因此不能提取得到细胞核；发育7d的黄化子叶提取细胞核效果,杂质少、细胞核完整,且提取率为100%。

对提取的细胞核浓度进行了比较,发现取80mg的黄化子叶,加入30μl的细胞核贮存液所获得的细胞核浓度为5×106-7个/ml,适宜进行DNA纤维的制备,而加入60μl的细胞核贮存液获得的细胞核浓度则过低,不适宜于DNA纤维的制备。

对DNA纤维的伸展方法进行了比较,发现重力自然拉伸法与载玻片推动涂抹法制备的DNA纤维质量相对较差,重力自然拉伸法制备的DNA纤维,可能会出现DNA纤维交叉、重叠且分布不均匀,而载玻片推动涂抹法则可能会导致DNA纤维交叉、堆积、断裂与丢失；效果较好的是载玻片前端引流法,这种方法制备的DNA纤维伸展平直、分布均匀、无交叉重叠、无断裂且较为完整。

参考文献

[1]Higher axial-resolution and sensitivity pachytene fluorescence in situ hybridization protocol in tetraploid cotton[J].Kai Wang,Zaijie Yang,Changshen Shu,Jing Hu,Qiuyun Lin,Wenpan Zhang,Wangzhen Guo,Tianzhen Zhang.Chromosome Research.2009(8)

[2]Development of two loquat[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.]linkage maps based on AFLPs and SSR markers from different Rosaceae species[J].Ana Delia Gisbert,JoséMartínez-Calvo,Gerardo Llácer,María Luisa Badenes,Carlos Romero.Molecular Breeding.2009(3)

[3]Resolution of fluorescence in-situ hybridization mapping on rice mitotic prometaphase chromosomes,meiotic pachytene chromosomes and extended DNA fibers[J].Zhukuan Cheng,C.Robin Buell,Rod A.Wing,Jiming Jiang.Chromosome Research.2002(5)

[4]High‐resolution physical mapping in Arabidopsis thaliana and tomato by fluorescence in situ hybridization to extended DNA fibres[J].Paul F.Fransz,CarlosAlonso‐Blanco,Tsvetana B.Liharska,Anton J.M.Peeters,PimZabel,J.HansJong.The Plant Journal.2002(3)

[5]陈卫娅.枇杷DNA纤维制备及Fiber-FISH技术体系的建立与应用[D].西南大学,2013.