活性蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

活性蛋白提取试剂盒用于从动物组织中提取有活性的总蛋白，该试剂由一种温和的非离子型去污试剂、缓冲试剂和氯化钠等组成。采用匀浆或超声破碎时，该试剂高效提取的蛋白质可以尽可能地保持活性，可以用于1D和2D电泳、免疫共沉淀、Pull down、EMSA、报告基因分析（Luciferase、β-galactosidase、Chloramphenicol Acetyltransferase等）、蛋白质激酶分析（PKA、PKC、Tyrosine Kinase等）、酶免分析（Western Blot、ELISA、RIA）、蛋白质纯化等实验，含有的去污试剂可通过透析去除。

活性蛋白提取试剂盒由抽提试剂、蛋白酶抑制剂混合物、DTT和PMSF组成。

活性蛋白提取试剂盒

特点：

整个实验过程只需要20 min左右；

可以处理20×100 mg的动物组织样品；

提取的蛋白质可以透析去除离子和去污试剂，或将缓冲液替换为所需要的合适缓冲液；

提取的活性蛋白质保持非变性状态，可以直接用于1D和2D电泳、Pull Down、EMSA、免疫共沉淀、蛋白纯化、酶活分析等实验；

可以维持报告基因酶（Luciferase、β-galactosidase、Chloramphenicol Acetyltransferase等）、蛋白质激酶（PKA、PKC、Tyrosine Kinase等）的活性。

操作步骤

1.将100 mg组织剪切成小块，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，加入适量的预冷的1X PBS于4°C，700 g（3000

rpm）离心3 min，弃掉上清，重复洗涤两次。

2.向以上洗涤后的组织中加入1 mL预冷的抽提试剂（使用前向每1 mL抽提试剂中加入1μl DTT，10μl PMSF，1μl蛋白酶

抑制剂），置玻璃匀浆器冰上均质30~50次至组织完全成匀质状液体无明显组织小块。

3.速度涡旋振荡10 sec，冰上放置20 min，期间取出振荡3~5次，再于4°C，12830g（12000 rpm）离心10 min以沉

淀组织或细胞碎片，转移上清为组织活性总蛋白部分，分装并保存于-80°C，用于下游实验。

应用^[4][5]

用于家蝇幼虫蛋白提取物的抗病毒、抗氧化及护肝作用研究

以家蝇幼虫为研究对象,从家蝇幼虫体内提取了生物活性蛋白物质,并研究了其抗病毒、抗氧化和护肝作用,主要研究结果如下:1.家蝇幼虫组织匀浆液的抗病毒作用在体外,采用鸡胚法和乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒检测了家蝇幼虫组织匀浆液的抗病毒活性。

实验结果表明:不同浓度的家蝇幼虫组织匀浆液对流感病毒在鸡胚内的增殖都有显著的抑制作用。试剂盒的检测结果也说明:家蝇幼虫组织匀浆液在体外对乙肝病毒表面抗原有很好的破坏作用,其破坏率可达87.5%。

2. 家蝇幼虫活性蛋白的提取、分离纯化及活性研究以脱脂蝇蛆粉为材料,根据蛋白质溶解性的不同,从家蝇幼虫体内提取了5类蛋白质,并分别研究了其抗病毒和抗氧化的活性。对其中含量高并且抗氧化和抗病毒活性好的组分进行了进一步的分离,并且确定了的制备工艺。采用阳离子交换色谱将蛋白质提取物进一步分离并检测了各组分的抗病毒活性。

研究结果表明:脱脂蝇蛆粉中清蛋白的含量最高,并且抗氧化和抗病毒活性,以此为目的蛋白,进一步分离得到蛋白质提取物。蛋白质提取物的提取条件为pH 7.0,盐浓度0.18mol/L。从蛋白质提取物中分离出4个蛋白质组分A1-4,抗病毒活性显示,这4个组分对流感病毒有一定的抑制作用,但活性与蛋白质提取物相比没有提高。

参考文献

[1]Molecular characterization and expression of the antimicrobial peptide defensin from the housefly（Musca domestica）[J].J.-X.Wang,X.-F.Zhao,Y.-L.Liang,L.Li,W.Zhang,Q.Ren,L.-C.Wang,L.-Y.Wang.Cellular and Molecular Life Sciences.2007(24)

[2]Cloning and analysis of antiviral activity of a barramundi（Lates calcarifer）Mx gene[J].Y.C.Wu,S.C.Chi.Fish and Shellfish Immunology.2006(1)

[3]Effective protection of Terminalia catappa L.leaves from damage induced by carbon tetrachloride in liver mitochondria[J].Xinhui Tang,Jing Gao,Yanping Wang,Yi-Mei Fan,Li-Zhi Xu,Xiao-ning Zhao,Qiang Xu,Zhong Ming Qian.The Journal of Nutritional Biochemistry.2006(3)

[4]Protective effect of Lygodium flexuosum（L.）Sw.extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats[J].P.J.Wills,V.V.Asha.Journal of Ethnopharmacology.2006(3)

[5]王芙蓉.家蝇幼虫蛋白提取物的抗病毒、抗氧化及护肝作用研究[D].华中农业大学,2008.