十六烷基三甲基溴化铵培养基的应用

背景^[1-3]

十六烷基三甲基溴化铵培养基用于绿脓杆菌及其它革兰氏阴性非发酵菌的选择性分离培养。

环凯十六烷三甲基溴化铵培养基原理：

蛋白胨和牛肉膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子;氯化钠维持均衡的渗透压;十六烷三甲基溴化铵为选择性抑菌剂，作为一种季铵盐阳离子去污剂可释放细菌细胞中的氮和磷而抑制非绿脓杆菌的细菌;琼脂是培养基的凝固剂。

环凯十六烷三甲基溴化铵培养基配方(每升)：牛肉膏粉3g；蛋白胨10g；氯化钠5g；十六烷三甲基溴化铵0.3g；琼脂15g；最终pH7.5±0.2。

十六烷基三甲基溴化铵培养基

十六烷三甲基溴化铵培养基使用方法：

1、称取十六烷三甲基溴化铵培养基

(溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基)33.3g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，115℃高压灭菌20min，待冷至50℃左右，倾注无菌平皿，凝固后备用。

2、取待检菌的新鲜纯培养物划线接种于平板上，置36±1℃培养18—24h。

3、观察结果。凡绿脓杆菌在此培养基上生长，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有漫延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。

应用^[4][5]

用于抗绿脓杆菌的活性物质筛选及其有效成分分析研究

从微生物中筛选拮抗绿脓杆菌的菌株，并对其活性成分进行分离和鉴定，为将来进行新型抗绿脓杆菌药物研究奠定基础。

主要研究内容：1.拮抗绿脓杆菌的微生物筛选。从土壤样品中筛选对绿脓杆菌有拮抗作用的菌株，进行形态学观察及16S rDNA序列分析，确定其分类地位。

2. 拮抗绿脓杆菌的活性成分表达条件优化。对不同培养基、pH值、温度和时间等条件下，抗绿脓杆菌成分的活性进行比较，获取适宜的发酵条件。

3. 拮抗绿脓杆菌的活性成分的纯化。收集发酵液，采用硫酸铵沉淀、离子交换、分子筛等方法从发酵上清中纯化目的蛋白。

4. 拮抗绿脓杆菌的活性成分的特性分析。测定活性成分的酸碱稳定性，蛋白酶K敏感性，高温耐受性，分子量，等电点（pI）等特性。

主要研究结果：1.从土壤样品中筛选出了5株对绿脓杆菌有拮抗作用的菌株。经菌落形态、革兰氏染色等形态学观察，16S rDNA扩增、测序及RDP序列分析，明确了所筛选的菌株分属假单胞菌属（Pseudomonad aceae）和不动细菌属（Acinetobacter）。

2. 以筛选出的B1505菌为供试菌，从11种培养基中优选出最适宜拮抗绿脓杆菌活性成分表达的培养基（酵母膏3g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl3g/L，葡萄糖5g/L）。该活性成分的最适发酵pH值为7.0、最适温度为37℃。在上述条件下，250rpm培养48h-64h，发酵液拮抗绿脓杆菌的活性最强。

3. 发酵液分别采用饱和度60%的硫酸铵或pI6.0沉淀后，经G-75分离，获得了纯度为80%的目的蛋白。

4.拮抗绿脓杆菌的活性成分的特性分析表明，该活性成分易被蛋白酶K水解，不耐高温，分子量约35KD，pI6.1，是一种抗菌蛋白。

参考文献

[1]Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii:resistance mechanisms and implications for therapy[J].Zavascki,Carvalhaes,Pic?o,Gales.Expert Review of Anti-infective Therapy.2010(1)

[2]Divorcing folding from function:How acylation affects the membrane-perturbing properties of an antimicrobial peptide.[J].Vad B,Thomsen LA,Bertelsen.Biochimica et biophysica acta:BBA:International journal of biochemistry,biophysics and molecular biololgy.Proteins and Proteomics.2010(4)

[3]Antimicrobial mechanism of pore-forming protegrin peptides:100 pores to kill E.coli[J].Dan Bolintineanu,Ehsan Hazrati,H.Ted Davis,Robert I.Lehrer,Yiannis N.Kaznessis.Peptides.2009(1)

[4]Inducible resistance of fish bacterial pathogens to the antimicrobial peptide cecropin B.[J].Sallum Ulysses W,Chen Thomas T.Antimicrobial agents and chemotherapy.2008(9)

[5]卫泽峰.抗绿脓杆菌的活性物质筛选及其有效成分分析[D].重庆理工大学,2012.