改良布氏(BREWER)硫代羟乙酸盐培养基的应用

背景^[1-3]

改良布氏(BREWER)硫代羟乙酸盐培养基用于厌氧菌和微需氧菌的培养。

成分：(g/L)Proteose Peptone 10.00；Infusion from Beef 17.50；Dextrose 5.00；Sodium Chloride 5.00；Dipotassium Phosphate 2.00；Sodium Thioglycollate 0.50；Methylene Blue 0.002；Agar 0.50。

厌氧菌（anaerobic bacteria）也叫厌气菌。是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，而不能在空气（18%氧气）和（或）10%二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的细菌。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行。

改良布氏(BREWER)硫代羟乙酸盐培养基

厌氧菌尚无公认的确切定义，但通常认为这是一类只能在低氧分压的条件下生长，而不能在空气（18%氧气）和（或）10%二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的细菌。按其对氧的耐受程度的不同，可分为专性厌氧菌、微需氧厌氧菌和兼性厌氧菌。

根据对O₂的耐受程度，可将厌氧菌分为三大类：

（1）对氧极端敏感的厌氧菌：代表菌种为月形单胞菌，这类细菌对厌氧条件要求很高，在空气中暴露10min即死亡，临床上很难分离出。

（2）中度厌氧菌：代表菌种为脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌等临床分离常见的厌氧菌。它们在空气中暴露60～90min或在脓汁抽出72h后仍然能分离出来。

（3）耐氧厌氧菌：代表菌种为溶组织梭菌。这类细菌不能利用氧，在无氧条件下生长好，而在有氧条件下生长不佳。

应用^[4][5]

用于古井窖泥菌群中厌氧菌的纯化培养与分子鉴定研究

利用厌氧培养、纯培养技术以及16S全长高通量测序对窖泥中的（厌氧）微生物群落进行分离鉴定及宏基因组测序,得到了窖泥中部分厌氧菌的名单,并将厌氧培养得到的纯菌落名单与高通量测序名单进行比较。

窖泥和酒醅以及酒醅-底层窖泥界面的黄水被用作制备培养基的主要部分,配以厌氧气体在厌氧工作站对黄水及底层窖泥中的微生物进行厌氧培养,利用该方法可以得到大量厌氧菌落。

确定培养条件后,对不同质量窖泥中的微生物进行培养,记录多种形态学参数,并进行统计分类。对代表性菌落进行基因组DNA提取,全长16S r DNA扩增和Sanger测序。结果证明,大多数菌落属于梭菌和乳酸杆菌,但绝大多数测序的菌落无法查到详细的分类信息。

利用16S全长高通量测序技术,对打分结果有明显差异的酒样对应的19个窖泥样本进行测序。得到窖泥中非常复杂的厌氧菌物种排名名单。

将不同质量窖泥的优势菌群名单分别与厌氧培养分离测序结果进行比较,发现一些厌氧培养分离出的梭菌属（Clostridium bornimense,Lactobacillus brevis）并未见于高通量测序结果中。即证明了高通量测序结果并不完全。鉴于厌氧培养并测序得到的菌种信息相对比较单一（只有梭菌和乳酸杆菌）,这也说明窖泥中厌氧菌的培养方法还需进一步深入研究。

参考文献

[1]Combining culture-dependent and culture-independent molecular methods for the isolation and purification of a potentially novel anaerobic species from pit mud in a Chinese liquor distillery[J].Liu,Chaolan,Huang,Dan,Zhang,Wenxue Journal of the Institute of Brewing.2016,

[2]Identification and quantification of the caproic acid-producing bacterium Clostridium kluyveri in the fermentation of pit mud used for Chinese strong-aroma type liquor production[J].Hu,Xiao-long,Du,Hai,Xu,Yan International Journal of Food Microbiology.

[3]Difference of microbial community stressed in artificial pit muds for Luzhou-flavour liquor brewing revealed by multiphase culture-independent technology[J].Zhang,L.,Zhou,R.,Niu,M.,Journal of applied microbiology.

[4]Cultivable Fusobacterium species in chronic periodontitis microbiota identified with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[D].Kim,Ji Sun 2015

[5]韩颖．古井窖泥菌群中厌氧菌的纯化培养与分子鉴定[D]．哈尔滨工业大学,2017