人胚肺细胞WI-38的应用

背景^[1-3]

人胚肺细胞WI-38是LeonardHayflick建系有限传代细胞系寿命为50±10代（倍增时间24h）来自妊娠3个月的正常胚胎肺组织。该细胞系用于人疫苗制备的人二倍体细胞，培养基中添加TNFα可以加快细胞生长。

人胚肺细胞WI-38

WI-38人胚肺成纤维细胞培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于黄芩素对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响研究

研究黄芩素（Baicalein,BAE）对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响，并初步探讨其作用机制。

方法:体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，制备TGF-β1诱导肺成纤维细胞WI-38向肌成纤维细胞分化的细胞模型。采用MTT法检测WI-38细胞的增殖率，WesternBlot法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-SMA）、I型胶原蛋（CollagenI,ColI）及相关蛋白表达的变化，光学显微镜观察细胞形态，免疫组化检测细胞内α-SMA蛋白表达。

随后在TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞WI-38向肌成纤维细胞分化的细胞模型上，给予不同剂量的BAE干预，用MTT法检测BAE对WI-38细胞的增殖的影响，免疫组化法观察WI-38细胞内α-SMA、Smad2蛋白的表达，透射电镜观察WI-38细胞中细胞器的结构改变，扫描电镜观察WI-38细胞表面结构改变。WestornBlot检测WI-38细胞分化过程中相关蛋白α-SMA、ColI、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白的表达，以ReverseTranscriptionPCR法检测BAE对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞WI-38细胞向肌成纤维细胞分化过程中α-SMA、ColI、Smad2、Smad3、Smad7mRNA表达的影响。

结果：MTT法检测表明：与正常WI-38细胞组相比，540μg·L-1TGF-β1作用WI-38细胞4d后，细胞增殖率上升（P<0.05,P<0.01），呈剂量依赖性；光学显微镜下可见：细胞增殖显著，细胞形态改变，从较大的纺锤形或星形结构的成纤维细胞分化为扁平状纤维结构的肌成纤维细胞，分化明显；

免疫组化荧光检测显示：正常WI-38细胞组α-SMA蛋白仅在细胞核内表达，模型组α-SMA蛋白在细胞核与胞浆内均表达；WesternBlot结果：TGF-β1体外诱导4d后，WI-38细胞内α-SMA、ColI蛋白的表达均上调，这一结果与免疫组化结果一致。

参考文献

[1]Induction of cardiac fibroblast lysyl oxidase by TGF-β1 requires PI3K/Akt,Smad3,and MAPK signaling[J].Tetyana G.Voloshenyuk,Elizabeth S.Landesman,Elena Khoutorova,Andrew D.Hart,Jason D.Gardner.Cytokine.2011(1)

[2]Alteration of fibroblast phenotype by asbestos-induced autoantibodies[J].Jean C.Pfau,Sheng&rsquo,ai Li,Sara Holland,Jami J.Sentissi.Journal of Immunotoxicology.2011(2)

[3]Suppression of TGF-β1/SMAD pathway and extracellular matrix production in primary keloid fibroblasts by curcuminoids:its potential therapeutic use in the chemoprevention of keloid[J].Yi-Chiang Hsu,Ming-Jenn Chen,Ya-Mei Yu,Shun-Yao Ko,Chi-Chang Chang.Archives of Dermatological Research.2010(10)

[4]Differential susceptibility to epithelial-mesenchymal transition（EMT）of alveolar,bronchial and intestinal epithelial cells in vitro and the effect of angiotensin II receptor inhibition[J].Stephen T.Buckley,Carlos Medina,Carsten Ehrhardt.Cell and Tissue Research.2010(1)

[5]董丽霞.黄芩素对TGF-β_1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响[D].苏州大学,2013.