新型PROTEIN A 固定纤维素树脂,用于抗体纯化

背景^[1-3]

新型PROTEIN A固定纤维素树脂,用于抗体纯化是一种新型Protein A的固定纤维素树脂，Protein A经过修饰后可以与免疫球蛋白Fc域特异性结合。使用这种新型Protein A，在温和条件下即可洗脱抗体。强耐碱性和高抗体结合能力，可用于抗体纯化。

新型PROTEIN A固定纤维素树脂设计用于从生物液体和细胞培养基中简易地一步纯化免疫球蛋白，包括各个亚型IgG或者IgG片段。

新型PROTEIN A 固定纤维素树脂

来源于大肠杆菌表达的重组ProteinA与天然ProteinA有着相同的功能，它含有4个可以和各个种属IgG分子的Fc段高特异性结合的结构域。ProteinA是纯化兔、豚鼠、狗和猫IgG的首选。Abbkine优化的偶联配方，确保了抗体产量，稳定性以及可溶性的达到平衡。

ProteinA是一种来源于金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，由五IgG结合区域组成，其分子量为42kDa。ProteinA能够结合大多数免疫球蛋白重链的Fc区域，也可以结合人类VH3家族的Fab区域。如果在血清中发生这样的相互作用，IgG蛋白将会被错误的结合，细菌便借此扰乱了机体的调理素作用和正常生理机能。

抗体亲和纯化的基础是protein G和protein A对不同物种IgG的Fc区域的高亲和力和特异性。带有固定在一些不同基质的protein G和protein A的层析介质，从而提供一种从腹水、细胞培养上清和血清中分离IgG和IgG亚类的卓越方法。

带有重组protein L配体的层析介质用于抗体和抗体片段的纯化。Protein L对kappa轻链的可变区有很强的亲和力，能够广泛用于捕获抗体片段比如Fab片段、单链可变区片段（scFv）和结合域抗体（Dabs）。

应用^[4][5]

用于抗GNA兔单克隆抗体的制备及其夹心ELISA检测体系的建立研究

通过获得高质量杂交瘤细胞的基础上,运用抗体重组技术获得兔单克隆抗体,以使收集得到的兔单克隆抗体的免疫捕获能力进一步提高最终建立一种检测GNA蛋白的基于兔单克隆抗体双抗夹心ELISA检测体系。

其主要实验内容和结果如下：（1）抗GNA兔多克隆抗体的制备及鉴定运用SDS-PAGE凝胶电泳对GNA免疫抗原蛋白的分子量和纯度进行检测。结果表明,GNA蛋白分子量约为14.3KDa,且纯度较高,可作为独立的抗原引起机体的免疫反应。用BCA蛋白检测试剂盒测得GNA蛋白的浓度为1.64mg/mL。采用免疫技术,将GNA蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后注射入两只兔子（B3365,B3366）体内。

经五次免疫之后选择免疫效价较高的兔子（B3366）,取全血,经Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化兔多抗血清,并对其纯度和效价分别进行凝胶电泳和间接ELISA检测。结果表明,所获得的抗GNA兔多克隆抗体纯度较高,几乎不含其它杂蛋白,效价在8000～32000之间。

（2）抗GNA兔单克隆抗体的制备及鉴定免疫两只兔子（B3365,B3366）,选取效价较高的B3366号兔子的脾脏进入细胞融合阶段。

（3）将兔子脾脏淋巴细胞与240E骨髓瘤细胞融合。运用间接ELISA法,经过初筛复筛,获得双阳性克隆子6个（zju-17-2、zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6、zju-17-14、zju-17-17）,取其中三个（zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6）进入抗体质粒重组阶段,选取分泌单克隆抗体能力强且抗体亲和性高的配对（zju-17-5（2L/2H））,进入单克隆抗体的大转生产,最后将收集到的抗GNA兔单克隆抗体经Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化。

经SDS-PAGE凝胶电泳分析,证实了该兔单克隆抗体的纯度高,运用IgG检测技术和间接ELISA检测技术,分别获得该目标抗体的初始浓度为2.28mg/mL,效价在32000～128000之间,亲和常数为0.387×109L/mol。

参考文献

[1]Extraction and characterization of protein fractions from Australian canola meals[J].Siong H.Tan,Rodney J.Mailer,Christopher L.Blanchard,Samson O.Agboola.Food Research International.2011(4)

[2]A multiplex nested PCR assay for the simultaneous detection of genetically modified soybean,maize and rice in highly processed products[J].Ao Jinxia,Li Qingzhang,Gao Xuejun,Yu Yanbo,Li Lu,Zhang Minghui.Food Control.2011(10)

[3]Plant lectins as defense proteins against phytophagous insects[J].Gianni Vandenborre,Guy Smagghe,Els J.M.Van Damme.Phytochemistry.2011(13)

[4]Pyramided rice lines harbouring Allium sativum（asal）and Galanthus nivalis（gna）lectin genes impart enhanced resistance against major sap-sucking pests[J].Y.Bharathi,S.Vijaya Kumar,I.C.Pasalu,S.M.Balachandran,V.D.Reddy,K.V.Rao.Journal of Biotechnology.2011(3)

[5]沈金儿.抗GNA兔单克隆抗体的制备及其夹心ELISA检测体系的建立[D].浙江大学,2013.