细菌跨膜蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

细菌跨膜蛋白提取试剂盒是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白提取试剂盒。细菌膜蛋白提取试剂盒可以从各种革兰氏阳性和阴性细菌中提取膜蛋白，可用于纯化膜蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。

该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。提取的蛋白用于二维电泳。

如需要用于报告基因检测、SDS-PAGE电泳检测、Western blotting、凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活分析等下游实验的试剂盒。

细菌跨膜蛋白电泳图

跨膜蛋白承担各种生物功能，扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。

使用方法：

1．每500μl细菌膜提取液A中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。

2．将菌液在低温下10000×g离心5分钟，收集菌体，用PBS洗菌体2次。

3．按每100mg湿重菌体样本加入500μl抽提液A(大约菌体和提取液体积比1:2-1:3，完全淹没菌体即可)，混匀，冰上放置2-3小时，中间每隔30分钟振荡混匀30秒。

4．将提取液在低温下12000×g离心5分钟，取上清。

5．在上清中加入10μl抽提液B，充分混匀。

6．在37℃水浴10分钟。

7．在37℃1000×g离心3分钟。

8．小心吸取管底部大约50μl液体。

9．用1-2倍膜蛋白溶解液C溶解该溶液，既得细菌膜蛋白样品。

应用^[4][5]

用于辣椒素对肥胖小鼠肠道菌群的影响及其降脂机制研究

辣椒素通过降低慢性、低程度炎症反应（CLGI）发挥降脂作用。以8周龄雌性KO小鼠为试验动物,分为3组,每组10只,在饲喂标准脂肪含量饲料、高脂肪含量饲料、高脂肪含量饲料+灌胃2 mg/kg辣椒素12周后,测定辣椒素作用后肠道中LPS受体Toll样受体4（TLR4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）炎性因子的表达、胞质蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin的表达以及血液中LPS、TNF-α、和IL-6的浓度等CLGI相关指标。

结果发现,辣椒素通过降低肠道中变形菌门的大肠杆菌属、幽门螺杆菌属、脱硫弧菌属和萨特氏菌属细菌的相对丰度,从而减少肠道中LPS的浓度,然后降低由TLR4的介导的TNF-α和IL-1β表达量,使肠道局部炎症减弱;局部炎症减弱导致紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达升高,肠道屏障功能得到恢复,使肠道的通透性降低,减少了进入血液循环中的LPS浓度;减轻的内毒素血症,导致血液中TNF-α和IL-6等炎性因子的浓度降低,减弱CLGI,从而最终达成辣椒素降脂减肥的作用,证实辣椒素通过降低CLGI发挥降脂作用的机制。

研究辣椒素对肠上皮细胞炎症反应和屏障功能的影响,体外试验验证辣椒素通过降低CLGI发挥降脂作用。运用CRISPR/Cas9技术自行成功构建了TRPV1基因敲除的肠上皮细胞株Caco-2(TRPV1-/-),并以其做为试验模型,分为对照组、1μg/mL LPS组和1μg/mL LPS+75μM辣椒素3个试验组,测定细胞上TLR4、TNF-α、和IL-6的mRNA表达量、细胞上清液中TNF-α、和IL-6炎性因子的浓度、跨膜蛋白ZO-1和胞质蛋白Occludin的mRNA和蛋白表达量以及细胞跨膜电阻值（TEER）。

参考文献

[1]Conserved shifts in the gut microbiota due to gastric bypass reduce host weight and adiposity.Liou AP,Paziuk M,Luevano JM Jr,Machineni S,Turnbaugh PJ,Kaplan LM.Sci Transl Med.2013

[2]Application of Novel PCR-Based Methods for Detection,Quantitation,and Phylogenetic Characterization of Sutterella Species in Intestinal Biopsy Samples from Children with Autism and Gastrointestinal Disturbances.Brent L.Williams,Mady Hornig,Tanmay Parekh.MBIO.2012

[3]The common hepatic branch of the vagus is not required to mediate the glycemic and food intake suppressive effects of glucagon-like-peptide-1.Matthew R.Hayes,Scott E.Kanoski,Bart C.De Jonghe.AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-REGULATORY INTEGRATIVE AND COMPARATIVE PHYSIOLOGY.2011

[4]Adipokines in inflammation and metabolic disease.Ouchi Noriyuki,Parker Jennifer L,Lugus Jesse J,Walsh Kenneth.Nature reviews.Immunology.2011

[5]王远微.辣椒素对肥胖小鼠肠道菌群的影响及其降脂机制研究[D].西南大学,2020.