TM3小鼠睾丸间质细胞的应用

背景^[1-3]

TM3小鼠睾丸间质细胞来源于雄性小鼠睾丸间质的上皮细胞样贴壁细胞，生长培养基：DMEM/F12＋5%HS＋2.5%FBS＋1%P/S。 TM3细胞在LH作用下cAMP产量升高，但对促卵泡激素没有响应。TM3细胞对LH的响应持续时间与血清批次有关；在LH存在下，TM3细胞可以代谢胆固醇。

TM3小鼠睾丸间质细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM/F12培养基；优质胎牛血清，2.5%；马血清，5%；双抗，1%。注：只使用单一血清培养，无法保证细胞状态。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于自噬在溶血磷脂酰胆碱诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡中的作用研究

通过体外细胞实验探讨LPC对小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响,同时观察自噬在LPC诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用。

方法:用MTT法检测LPC对小鼠睾丸间质TM3细胞活性的影响;用氧化应激检测试剂盒检测LPC对小鼠睾丸间质TM3细胞氧化应激的影响;分别用Western blot和Annexin V-FITC/PI双染色法检测LPC对小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡的影响;用Western blot检测LPC对小鼠睾丸间质TM3细胞自噬的影响。

结果:用不同浓度的LPC（0,2.5,5,10,20,40,80,160μM）处理小鼠睾丸间质TM3细胞48 h,MTT结果显示,2.5,5和10μM浓度的LPC可显著抑制TM3细胞活性,而20,40,80,160μM浓度的LPC抑制TM3细胞活性则更显著（P<0.05）。

随后用0,2.5,5,10μM浓度的LPC处理小鼠睾丸间质TM3细胞48 h后,用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达情况;结果显示,LPC可增加小鼠睾丸间质TM3细胞内cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和Bax蛋白含量,并抑制Bcl-2蛋白的表达,提示LPC可诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡。

Annexin V-FITC/PI双染色法结果显示,LPC可显著增加Annexin V阳性细胞数,进一步证实LPC可诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡。

与对照组相比,LPC处理组中小鼠睾丸间质TM3细胞中GSH含量显著降低,而MDA含量则显著增加,同时LPC还呈浓度依赖式地抑制小鼠睾丸间质TM3细胞内SOD和GSH-PX的活性,提示小鼠睾丸间质TM3细胞内氧化应激可被LPC诱导产生;在用N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）抑制细胞氧化应激后,与LPC处理组相比,NAC抑制组细胞的活性增强,Western blot检测各凋亡蛋白的诱导均明显减弱。

参考文献

[1]Role of autophagy in di-2-ethylhexyl phthalate（DEHP）-induced apoptosis in mouse Leydig cells[J].Yingyin Sun,Jingcao Shen,Lin Zeng,Dan Yang,Shuxin Shao,Jinglei Wang,Jie Wei,Junping Xiong,Jiaxiang Chen.Environmental Pollution.2018

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[3]In vitro effect of myo-inositol on sperm motility in normal and oligoasthenospermia patients undergoing in vitro fertilization[J].P.G.Artini,E.Casarosa,E.Carletti,P.Monteleone,A.Di Noia,O.M.Di Berardino.Gynecological Endocrinology.2017(2)

[4]Teratozoospermia and asthenozoospermia are associated with specific epigenetic signatures[J].T.G.Jenkins,K.I.Aston,J.M.Hotaling,M.B.Shamsi,L.Simon,D.T.Carrell.Andrology.2016(5)

[5]曾林.自噬在溶血磷脂酰胆碱诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡中的作用[D].南昌大学,2019.