MH-S小鼠肺泡巨噬细胞的应用

背景^[1-3]

MH-S小鼠肺泡巨噬细胞是通过SV40转化富含粘附细胞鼠肺的小泡巨噬细胞获得的，抗原表达CD11b(Mac-1);II类抗原（IA）；T抗原，表达白细胞介素1(IL-1)基因。生长培养基：RPMI-1640＋0.05mMβ-巯基乙醇＋10%FBS＋1%P/S；培养条件气相：空气，95%；CO2，5%温度：37℃。

MH-S小鼠肺泡巨噬细胞

MH-S小鼠肺泡巨噬细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于重组腺病毒Ad-Dectin-1转染小鼠肺泡巨噬细胞及其在烟曲霉感染中的作用研究

重组腺病毒Ad-Dectin-1体外转染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,构建Dectin-1高表达的细胞模型。

材料与方法：重组腺病毒Ad-Dectin-1体外转染MH-S细胞（Ad-Dectin-1-EGFP组）,荧光显微镜观察转染情况,MTT法检测细胞增殖情况,确定转染的感染复数（multiplicity of infection,MOI）值。Real-time PCR法检测Dectin-1基因mRNA表达量,Western blot检测Dectin-1蛋白表达量,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞膜表面Dectin-1表达情况。同时设不转染腺病毒的MH-S细胞为空白对照,转染空病毒的MH-S细胞为阴性对照（Ad-EGFP组）。

结果：重组腺病毒转染MH-S细胞12h即可见少量绿色荧光表达,48 h荧光强度达到峰值,MOI值为2200时细胞增值率下降,转染MOI值为1800。Real-timePCR和Western blot检测发现,Dectin-1基因mRNA和蛋白表达量均较Ad-EGFP组显著增加。

激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测进一步证实,细胞膜表面有Dectin-1表达,且表达量较Ad-EGFP组显著增加。

结论：重组腺病毒Ad-Dectin-1可在体外转染MH-S细胞,转染后Dectin-1基因mRNA和蛋白表达显著增加,Dectin-1高表达的细胞模型构建成功。

参考文献

[1]Adenoviruses as gene/vaccine delivery vectors:promises and pitfalls[J].Mohan Babu Appaiahgari,Sudhanshu Vrati.Expert Opinion on Biological Therapy.2015(3)

[2]Salvage combination antifungal therapy for acute invasive aspergillosis may improve outcomes:a systematic review and meta-analysis[J].Anil A.Panackal,Emilio Parisini,Michael Proschan.International Journal of Infectious Diseases.2014

[3]Treatment Options in Invasive Aspergillosis[J].Anil A.Panackal,John E.Bennett,Peter R.Williamson.Current Treatment Options in Infectious Diseases.2014(3)

[4]Functional expression of recombinant human macrophageβ-glucan receptor dectin-1 using baculovirus–silkworm expression system[J].Minoru Ujita,Shota Koike,Yosuke Yamauchi,Noburo Kiochi,Hiroki Yura,Mayumi Yamanaka,Hiroki Okumura.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry.2014(7)

[5]夏迪.重组腺病毒Ad-Dectin-1转染小鼠肺泡巨噬细胞及其在烟曲霉感染中的作用[D].南京大学,2015.