黄芩的基因组测序揭示黄芩素的生物合成的进化

摘要：黄芩是一种非常重要的中药材，主要是利用晒干的根部，在中国被称为“黄芩”。它主要用来治疗肝脏和肺上的问题，可以作为一种癌症治疗的补充药物。我们报道了一种高质量的黄芩参考基因组，其中408.14 Mb基因组的93%被用来组装成9个假-染色体，N50达到了33.2Mb。与其他唇形科相近的物种芝麻和一串红进行基因组比较，揭示了黄芩中与生物活性物质4’-脱氧黄酮的生物合成的代谢途径相关的基因。我们发现了一种特殊的肉桂酸辅酶A连接酶很可能最近的突变后获得了新的功能。在4’-脱氧黄酮的合成途径中，有四个基因编码的酶在黄芩基因组中是串联重复的。更深入的分析在黄芩属植物中揭示了基因的重复性，片段的重复，基因的扩增和点突变偶联基因的新功能和亚功能化涉及到了4’-脱氧黄酮的生物合成。在薄荷家族中，唇形科，我们的研究不仅为特定的黄酮生物合成途径的进化提供了重要的见解，而且为利用微生物的代谢工程或植物的分子育种来提高活性物质的生产提供了一种重要的工具。黄芩的参考基因组是非常有用的，可改进薄荷家族其他成员的基因组组装，为药用植物中生物活性化合物的合成途径的解码提供了重要的基础。

杂志名：Molecular Plant  （一区13.2）（Volume 12, Issue 7, 1 July 2019, Pages 935-950）

英文题目：The ReferenceGenome Sequence of Scutellaria baicalensis Provides Insights into theEvolution of Wogonin Biosynthesis

作者：QingZhao1…Yonghong Hu1, Xiao-Ya Chen1,2 and Cathie Martin1,7

单位：中国科学院上海辰山植物科学研究中心上海市植物功能基因组学与资源重点实验室，上海辰山植物园，上海

黄芩作为一种重要的中药，在中国已经有2000多年的历史。黄芩中的黄酮类物质具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、保肝和保护神经的作用。因此理解黄酮的合成途径变得尤为重要，了解其分子合成和调控机制为我们更好的利用黄酮提供基础。黄芩素是黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一。

黄芩中黄酮的生物合成有两条途径，一条路径是，phenylalanine ammonia lyase (SbPAL), cinnamate4-hydroxylase (SbC4H), 4-coumarate coenzyme A (CoA) ligase (SbCLL1), chalcone synthase(SbCHS-1), chalcone isomerase (SbCHI), and flavone synthase II (SbFNSII1),导致4’-脱氧黄酮的合成。在根部，出现了另一种黄酮合成路径（RSF），cinnamate-CoA ligase (SbCLL-7)。（图1）

图1 黄芩中黄酮的两条生物合成途径

目前，我们已经阐明了黄芩素和去甲汉黄芩素的生物合成途径，但最后一步去甲汉黄芩素到汉黄芩素的生物合成过程，是由8-O-甲基转移酶催化，还有待说明。因此全基因组测序是一种切实可行的策略，对天然化合物的代谢途径的识别非常有帮助。这里，我们采用了二代高通量Illumina和三代PacBio联合测序技术，报道了黄芩的参考基因组。总基因组大小为408.14 Mb,其中386.63 Mb组装到了染色体水平，达到了9个假染色体。将已公布的丹参、芨芨草和獐牙菜的基因组进行比较分析，RSFs生物合成的进化路径似乎是通过编码辅酶A连接酶的基因的特异性聚集而出现的(图1;SbCLL-7)以及多个串联基因复制(图1:SbCHS-2, SBFNSII-2, SBF8h)。通过对基因组和转录组序列的筛选，确定了负责汉黄芩素合成的O-甲基转移酶(OMTs)，并通过酵母体内实验和黄芩毛状根的RNAi实验证实了这一结果。

为了便于对黄芩基因组进行注释，获得黄芩基因的表达谱。我们对黄芩不同品系的花、花蕾、叶、茎、根和茉莉酸(JA)处理过的根的RNA样本进行了测序。每个组织的RNA样本以三份形式提取，并使用HiSeq 2000平台进行测序。总共得到了28930个基因。图2显示了基因、重复、非编码RNA密度和所有检测到的片段重复的概述。

图2 黄芩基因组组装的图谱概述

比较基因组分析，我们组装了黄芩基因组，并与其他10个基因组进行比较分析。我们识别了28133个基因家族，全部11个物种有共同6811个。我们比较了四个相近物种的基因组。全部11个基因组共有的299个单拷贝基因家族，根据其建立系统发育树。（图3）

图3 比较基因组分析

寻找RSF通路演化的线索，我们对黄芩、丹参、芨芨草和苘麻四种相近的植物进行了黄酮生物合成途径中关键酶的解析筛选。用三种4CL底物:肉桂酸，4-香豆酸和咖啡酸进行试验，发现肉桂酸是SbCLL-7的底物，SbCLL-7的活性位点狭窄，由疏水残基组成，有利于疏水底物，如肉桂酰腺苷酸，底物通过与Thr343和Asp424的氢键配位，而导致SbCLL-7能够使用肉桂酸作为底物的变化一定与CLL-7基因的点突变有关。（图4）

图4 黄芩中特殊ScCLL7的分析

黄芩编码两种CHS亚型，即SbCHS-1和SbCHS-2。SbCHS-1基因在地上部分高度表达，特别是在花中，并编码一种参与经典的黄酮和花青素生物合成的酶。黄芩黄酮合成酶II(FNSII)有两种亚型:FNSII-1在植物地上部分将水仙素转化为芹菜素，而FNSII-2在根中特异合成chrysin。黄芩基因组中有两个编码FNSII-1蛋白的基因，编号为Sb06g05860 (FNSII-1.1)和Sb03g20730 (FNSII-1.2)分别在假染色体6号和3号。SbCYP82D2是一种黄酮8-羟化酶，在根中只接受白杨素生成去甲汉黄芩素，分布在假染色体5号。

图5 黄芩CHS基因的进化过程

图6 SbFNSII和SbCYP82D基因的串联复制

我们在酵母中表达了五种PFOMT ORFs，并用去甲汉黄芩素作为底物去喂养细胞。所有五种酵母菌株都可以将去甲汉黄芩素转化为汉黄芩素。后进行RNAi干扰确定了OMT的基因功能。

图7 汉黄芩素（Wogonin）生物合成的候选PFOMT基因的筛选

讨论：特定的代谢物对植物适应不同环境非常重要，这些化合物通常是特异性的、严格调控的、高度可进化的。特定代谢途径的进化是由基因复制和随后的亚/新功能驱动的。黄芩属植物的黄芩素的RSF合成途径具有特异性。基于我们的比较基因组分析，我们现在可以描述这种特定的代谢途径可能是如何进化的。之后，对RSF途径上的每个酶进行系统分析，我们没有发现什么有用的基因聚类，但是发现了编码关键标记酶SbCLL-7的基因和编码下一步CHS-2酶的基因都位于假染色体9上。也许这是基因聚类促进多态群体中4’-脱氧黄酮生物合成的最早步骤共同进化的证据，尽管这一连锁并不紧密(两个位点大约有12000个基因分开)，但在目前的标准下还不能作为基因聚类的证据。

黄芩属的参考基因组的分析比较与高质量的两个密切相关的物种的基因组序列，已经允许我们提出这个黄酮的新代谢途径是如何进化和显示,一系列不同的进化机制导致了一个属中出现了特殊的代谢途径。与薄荷家族其他成员的高质量基因组进行相互比较，同样可以阐明萜类化合物的特殊生物合成途径的进化，如二萜丹参酮、酚酸和黄酮类化合物在这个代谢多样化的植物家族中的进化。