PIEC 猪动脉内皮细胞的应用

背景^[1-3]

PIEC猪动脉内皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法、并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来；细胞经CD31/vWF免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

PIEC猪动脉内皮细胞

猪动脉内皮细胞分离自主动脉组织；主动脉是体循环的动脉主干。其运行路径为：升主动脉起于左心室，至右侧第2胸肋关节高度移行为主动脉弓，弓行向左后至第4胸椎体下缘移行为降主动脉；在第12胸椎体高度穿膈的主动脉裂孔移行为腹主动脉，以上为胸主动脉，至第4腰椎体下缘分为左、右髂总动脉；髂总动脉在骶髂关节高度分为髂内、外动脉。

主动脉内皮细胞是覆盖在主动脉内面的单层细胞，可分泌一系列血管活性物质而保持血管稳态，当其受到炎症或其它因素刺激后稳态被破坏而导致一些心血管疾病的发生。

因此，主动脉内皮细胞已成为研究心血管疾病发病机制及治疗药物不可缺少的工具。内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成。它形成血管的内壁，是血管管腔内血液及其他血管壁（单层鳞状上皮）的接口。内皮细胞是沿着整个循环系统，由心脏直至最小的微血管。

应用^[4][5]

用于人α1，2岩藻糖苷转移酶（HT）基因转移及其抗异种移植免疫排斥的研究

运用分子生物学和基因工程技术构建含人α1,2岩藻糖苷转移酶（HT）基因的重组质粒pcDNA3-HTcDNA并在猪细胞表达,合成H抗原,同时降低异种抗原α-Gal的表达。

方法用HindⅢ/XbaⅠ双酶切pRc/CMV-HTcDNA和pcDNA3质粒,将切下来的HTcDNA定向连接在pcDNA3质粒,构建pcDNA3-HTcDNA重组质粒,对其进行PCR、多酶切和测序鉴定。

建立猪主动脉内皮细胞原代培养、猪髂动脉内皮细胞（PIEC）系和猪肾PK-15细胞系传代培养的方法。

采用脂质体转染法将pcDNA3-HTcDNA转染上述猪细胞,新霉素（G418）筛选具有抗性的细胞克隆,用PCR检测重组HT基因的整合,RT-PCR检测重组HT基因mRNA的表达,流式细胞术（FCM）检测转染细胞H抗原和异种抗原α-Gal的表达。

分别以未转染的相应正常猪细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为对照。结果重组质粒转染3种猪细胞经筛选均得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,RT-PCR证实人HT基因mRNA在猪细胞表达,FCM检测转染细胞H抗原表达升高,α-Gal表达明显降低。

结论转移的重组人HT基因可以在猪细胞表达,合成H抗原,同时降低异种抗原α-Gal的表达。选用巨细胞病毒（CMV）启动子可以使人HT基因在各种猪细胞广泛表达。

参考文献

[1]Characterization of two porcine endogenous retrovirus integration loci and variability in pigs[J].Marie Gorbovitskaia,Zhaoliang Liu,Noelle Bourgeaux,Ning Li,Zhengxing Lian,Patrick Chardon,Claire Rogel-Gaillard.Immunogenetics.2003(4)

[2]Absence of PERV specific humoral immune response in baboons after transplantation of porcine cells or organs[J].Ulrich Martin,Stefan J.Tacke,AndréR.Simon,Carsten Schr?der,Karsten Wiebe,B.Lapin,Axel Haverich,Joachim Denner,Gustav Steinhoff.Transplant International.2002(7)

[3]IL-5 and TNF-αParticipate in Recruitment of Eosinophils to Intestinal Mucosa in Ulcerative Colitis[J].Digestive Diseases and Sciences.2001(9)

[4]Natural killer cell-endothelial cell interactions in xenotransplantation[J].Jeffrey R.Dawson,Adriana C.Vidal,Anatoli M.Malyguine.Immunologic Research.2000(2)

[5]马志方.人α1，2岩藻糖苷转移酶（HT）基因转移及其抗异种移植免疫排斥的研究[D].天津医科大学,2005.