血液总RNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

血液总RNA提取试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从血液样品中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。30-40分钟内即可完成反应，提取的总RNA纯度极高，没有蛋白质和其他杂质污染。RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real-time RT-PCR、芯片分析、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等下游应用。

血液总RNA提取试剂盒

使用方法：

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1．红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液（例如待处理的血液样品体积为200μl，则取140μl 10×红细胞裂解液），用RNase-Free ddH2O稀释至1×红细胞裂解液。

2．向1体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液（需自备合适的干净管子)。

3．在冰上孵育10-15 min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。

4．4℃2,100rpm（~400×g)离心10min，将上清完全去除。

5．向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液（加入1×红细胞裂解液的体积是第1步中全血用量的2倍），重悬细胞。

6．4℃，2,100rpm（~400×g)离心10min，将上清完全去除。

7．向白细胞沉淀中加入裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇），具体加量按照下表进行，涡旋或使用移液器混匀。

8．将溶液转移至过滤柱CS中（过滤柱CS放在收集管中），12000rpm（~13400×g)离心2 min，弃去过滤柱CS，收集滤液。

9．向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为350μl或600μl），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中（吸附柱CR2放入收集管中），12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

10．向吸附柱CR2中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

11．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。

12．向吸附柱CR2中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15 min。

13．向吸附柱CR2中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

14．向吸附柱CR2中加入500μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

15．重复步骤14。

16．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

17．将吸附柱CR2转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-50μl RNase-Free ddH2O室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，得到RNA溶液。

应用^[4][5]

用于血液提取总RNA方法的优化及其在支气管肺发育不良患儿血液内TLK1表达的应用研究

以10名近胎龄、近似日龄的非BPD患儿抽取的静脉血为对照，分别采用TRIZOL法提取RNA，并采用反转录PCR（ReversedTranscript PCR）方法对所抽提的RNA反转录成cDNA。运用Real-Time PCR方法对BPD患儿血液TLK1产物做定量分析，采用△△Ct法，以GVPDH为内参，以非BPD患儿组为对照。

结果：1计算并通过比较TRIZOL法，在等量（0.1ml）全血、血浆及血清提取的总RNA的得率和质量分别为：全血提取RNA得率为（232.2904±58.42103）、纯度为（1.7421±0.6920），血浆提取RNA得率为（142.0728±45.24386）、纯度为（1.4765±0.5418），血清提取RNA的率为（198.7496±51.47629）、纯度为（1.5833±0.6257），因此，全血提取的总RNA的得率明显优于血清及血浆，总RNA的纯度也最高；

2.以不同的全血量通过不同剂量的TRIZOL提取总RNA比较，在0.1-1ml的全血量的范围内，以适量的TRIZOL提取的总RNA的量，全血量越多，提取的RNA的得率及纯度越高，但是，全血量越多，提取完整总RNA所需TRIZOL量越多，将不利于后期实验操作，因此选取的全血量进行提取血液RNA的实验对患者及后期实验研究非常重要。

参考文献

[1]TAT-Mediated Delivery of Tousled Protein to Salivary Glands Protects Against Radiation-Induced Hypofunction[J].Gulshan Sunavala-Dossabhoy,Senthilnathan Palaniyandi,Charles Richardson,Arrigo De Benedetti,Lisa Schrott,Gloria Caldito.International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics.2012(1)

[2]VEGF levels in humans and animal models with RDS and BPD:Temporal relationships[J].Stephanie Meller,Vineet Bhandari.Experimental Lung Research.2012(4)

[3]The Tousled-Like Kinases as Guardians of Genome Integrity[J].Arrigo De Benedetti,Y.-K.Jang,Y.B.Lebedev,A.J.Molenaar.ISRN Molecular Biology.2012

[4]Silencing of Tousled-like kinase 1 sensitizes cholangiocarcinoma cells to cisplatin-induced apoptosis[J].Yuichi Takayama,Toshio Kokuryo,Yukihiro Yokoyama,Satoko Ito,Masato Nagino,Michinari Hamaguchi,Takeshi Senga.Cancer Letters.2010(1)

[5]张珊.血液提取总RNA方法的优化及其在支气管肺发育不良患儿血液内TLK1表达的应用[D].山西医科大学,2014.